【摘要】：背景和目的 Cthrc1首先在受伤的大鼠血管中发现,它是一种分泌型的糖基化蛋白,具有抑制胶原表达和促进细胞运动的功能。在TGF-β家族的成员(BMP4, BMP2, TGF-β)的影响下,Cthrc1在纤维母细胞和软骨细胞中的表达升高。Cthrc1也跟很多重要的信号通路有关系,比如Wnt和TGF-β。体内外实验模型都证明了Cthrc1抑制TGF-β信号通路的功能是通过减少Smad2和Smad3的磷酸化实现的。Cthrc1在肿瘤的发生和转移中的表达升高,但是它在其过程中的作用还不清楚。最近的研究证明Cthrc1可以激活Wnt/PCP信号通路,它是非经典Wnt途径的一种。Cthrc1的激活状态是一种锚在细胞膜表面的一种N末端糖基化的三聚体。虽然Cthrc1在肿瘤的发生发展中的表达升高,但是其过表达的机制和其在病理过程中的功能还不清楚。 Wnt/PCP信号通路在恶性肿瘤的发展中起着复杂的作用。在恶性肿瘤的早期阶段,Wnt/PCP通过抑制Wnt/β信号通路来抑制肿瘤的发展。随着肿瘤的成长,在肿瘤的晚期阶段,Wnt/PCP被激活并且可以促进肿瘤细胞的转移和侵袭,从而促进了肿瘤的转移。先前的研究证明了Wnt/β信号通路在口腔鳞状细胞癌中是激活的状态。并且我们过去的研究也报道了,在口腔鳞状细胞癌中E-cadherin的大量的N末端糖基化引起的细胞之间粘附的松解。E-cadherin的过度的糖基化又是由于DPAGT1的过表达引起的,DPAGT1是N末端糖基化的重要的调节基因。然而,我们近期的研究显示,DPAGT1基因又是经典Wnt信号通路的靶基因。经典Wnt信号通路的激活能够导致Wnt蛋白的N末端糖基化的增加,例如Wnt3a和LRP5/6,并且能够通过这个正反馈环引起DPAGT1的进一步高表达。这个反馈环的不适当的激活就能够促进口腔鳞状细胞癌的增值。 Cthrc1是分泌型的糖基化蛋白,所以我们可以推测,Cthrc1在口腔鳞状细胞癌中的过表达或许是DPAGT1和Wnt/β信号通路形成的这个反馈环作用的结果。并且,Cthrc1可能在口腔鳞状细胞癌中通过激活Wnt/PCP信号通路来促进肿瘤细胞的迁移和肿瘤的转移。 方法 在口腔鳞状细胞癌肿瘤标本和人舌鳞状细胞癌细胞Ca127中我们用western blot和免疫荧光的方法检测了Cthrc1和DPAGT1的蛋白水平的表达。对Cthrc1进行了去糖基实验。在ca127细胞中,我们沉默掉DPAGT1基因,然后检测了Cthrc1蛋白的表达水平。染色质免疫沉淀实验检测了在Cthrc1启动子上β-catenin和TCF的结合位点。在Ca127田胞中我们沉默掉Cthrc1基因,然后进行了细胞移动实验和刮伤愈合实验。 结果 在口腔鳞状细胞癌中Cthrc1表达升高。Cthrc1在很多人类实性肿瘤中表达升高,所以我们在肿瘤标本和肿瘤的临近正常上皮组织中用western blot和免疫荧光的方法检测了其蛋白表达水平。Cthrc1的表达在肿瘤组织中比正常组织中有非常显著的增高。在免疫荧光的结果中我们看到,在肿瘤上皮岛中表达升高,而在正常组织中几乎没有表达。过去的研究表明,Cthrc1的激活状态是一个锚在细胞膜上的N末端糖基化的三聚体,并且N末端的糖基化对其锚在细胞膜上起着重要的作用。所以我们在肿瘤标本及正常组织中用western blot和免疫荧光的办法检测了DPAGT1的表达,发现DPAGT1在肿瘤组织里的表达远远超过正常组织。并且在免疫荧光中我们看到,在正常上皮组织中DPAGT1仅仅在基底层表达,而在肿瘤组织中则是整个肿瘤上皮岛都有高表达。Cthrc1是糖基化蛋白,所以我们进行了去糖基实验,发现Cthrc1的激活状态确实有N末端糖基修饰。 N末端糖基化能够增加口腔鳞状细胞癌中Cthrc1蛋白的稳定性。有研究证明N末端糖基化增加了Cthrc1的分泌,也是其锚在细胞膜上的重要因素。为了搞清楚N末端糖基化在Cthrc1过表达中起的作用,我们在cal27细胞中沉默掉了DPAGT1基因,从而使得N末端的糖基化减少。这样我们发现在沉默掉DPAGT1基因的cal27田胞中的Cthrc1的蛋白水平严重下降。随后我们用环己酰亚胺处理了经DPAGT1siRNA转染的ca127细胞及其对照组,我们发现N末端的糖基化使Cthrc1的半衰期增加,也就是增加了其稳定性。所以我们认为这可能是Cthrc1在口腔鳞状细胞癌中高表达的一个原因。 经典Wnt信号通路的激活也是口腔鳞状细胞癌中Cthrcl高表达的促进因素。我们过去的研究表明,在口腔鳞状细胞癌中DPAGT1与经典Wnt信号通路形成了一个正反馈的作用环。在我们的实验中,经过Wnt3a条件培养基培育过的ca127田胞的Cthrc1的表达水平增加。随后我们在染色质免疫沉淀实验中发现在Cthrc1的启动子上有β-catenin和TCF的结合位点。众所周知,β-catenin处在经典Wnt信号通路的最末端,TCF又是β-catenin的靶基因。所以经典Wnt信号通路的激活能够使Cthrc1勺表达升高。这也许是口腔鳞状细胞癌中Cthrc1蛋白表达升高的另一种机制。 Cthrc1促进了口腔鳞状细胞癌的迁移。我们大量的观察发现,利用DPAGT1cDNA上调Cthrc1表达之后,在刮伤愈合实验中伤口边缘的Cthrc1表达增多和伤口愈合加快,这都说明Cthrc1可能具有促进了细胞迁移的功能。因此我们在Ca127细胞中沉默掉Cthrc1,进行了细胞移动实验和刮伤愈合实验。在细胞移动实验中沉默组细胞移动率比对照组明显降低,在刮伤愈合实验中沉默组愈合速度比对照组明显减慢。这些结果表明在Ca127细胞中Cthrc1是具有促进细胞迁移的功能的。 DPAGT1转染的CAL27细胞中的Cthrc1在迁移的边缘位置表达升高的特点说明了Cthrc1的促进细胞迁移的功能是依赖于Wnt/RhoA信号通路的。确实如此,继western blot之后免疫沉淀实验表明Cthrc1与Wnt/PCP的配体Wnt5a,受体Fzd6有相互的结合作用。并且,Wnt5a在肿瘤中表达水平比正常组织中有明显的增高。所以,这些都说明在口腔鳞状细胞癌中,Cthrcl可能通过一个非经典Wnt信号通路Wnt/PCP信号通路来促进细胞的迁移。 结论 我们的结果证明了N末端糖基化和经典Wnt信号通路的激活能够引起Cthrcl的表达升高,也就是DPAGT1与Wnt/β信号通路形成的反馈环的异常激活能够导致Cthrc1在口腔鳞状细胞癌中的异常高表达。 结果也间接的说明,Cthrc1可能通过Wnt/PCP信号通路在口腔鳞状细胞癌的晚期促进癌细胞的迁移,从而导致肿瘤的转移。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.8
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