基于二氢卟吩e6抗菌光动力疗法抑制种植体周围炎相关致病菌的研究

发布时间：2020-07-22 05:44

【摘要】：近年来随着口腔种植的广泛应用,种植体周围炎的发病率不断增高,研究发现细菌的感染是导致种植体周围炎最主要的病因之一,而细菌生物膜是种植体周围炎的始动因子。和悬浮的细菌相比,细菌生物膜内的细菌的耐药性、毒力以及抵抗宿主免疫防御的能力更强,仅仅对悬浮致病细菌进行研究,并不能确切评估抗菌剂对细菌生物膜内细菌的抑制作用。为了更全面的评价材料的抗菌效果,对生物膜状态下细菌的研究必不可少。抗菌光动力疗法(Antimicrobial Photodynamic Therapy,aPDT)是选择性破坏细菌或者其他病原微生物的一种有效的方式。因其具有高靶向性、低损伤性、且易到达深层组织的特点,而得到了广泛的关注,同时其对多重耐药菌也起到了良好效果,因此逐渐的被应用于种植体周围炎的治疗之中。aPDT的抗微生物作用机理主要依赖于光敏剂、光源及氧三种因素,临床上大部分光敏剂的吸收光在紫外或可见光波段,但是他们穿透能力差,在临床应用中受到很多局限。掺杂镧系元素的上转换纳米颗粒(Lanthanide-doped upconversion nanoparticles,UCNPs),能够由穿透力较强的近红外光激发,上转化发射可见光和紫外光。UCNPs具有许多优点,如非自发荧光,抗菌性能好,化学稳定性高,穿透力强,寿命长,对组织损伤小等。因此我们设想,将以红光为激发光的光敏剂二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)结合UCNPs,既可以将穿透力强的近红外光(Near Infrared,NIR)上转换为红光,激发Ce6产生aPDT效应,同时这种设计,又可增强其化学稳定性,进而增强抗菌性能。并通过对UCNPs@Ce6进行硅烷化修饰,以增加其亲水性和生物利用度。最终我们通过掺杂不同比例的Mn~(2+)以增强红光的上转换性能,从而提高aPDT的抗细菌生物膜的能力。因此我们进行了以下实验研究:实验一:研究不同浓度的Ce6对于单菌种生物膜的抗菌性能影响。首先通过CCK8实验,研究不同浓度Ce6对小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性的影响,筛选出Ce6可用的最大浓度。再通过细菌生物膜死/活染色,菌落形成单位(CFU)计数确定细菌存活率,MTT检测生物膜代谢活性,检测细菌生物膜的量,硫酸-苯酚法检测多糖产量等一系列实验,对三种不同细菌:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis),中间普氏菌(Prevotella intermedia,P.intermedia),具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)的单菌种口腔生物膜的抗菌性能进行检测。结果发现,三种单菌种生物膜在数量、活性、多糖产量等方面都有所降低,且具有统计学差异(P0.05)。实验表明:Ce6对单菌种细菌生物膜具有一定的杀菌作用。但是随着Ce6浓度的增加,并未见其抗菌能力增强。可能是因为Ce6受红光激发,而红光的穿透性弱,且Ce6的水溶性很差,不利药物的渗透,因而影响aPDT的治疗效果,所以单纯应用Ce6有一定的抗菌的效果,但仍没有达到我们的预期疗效。实验二:UCNPsMn@Ce6@silane的合成及表征。合成UCNPs@Ce6,将UCNPs@Ce6硅烷化修饰增加其亲水性,并添加不同比例的Mn~(2+)来增强其红光转换强度,合成新型纳米复合材料UCNPsMn@Ce6@silane。激发光由红光改为NIR增强其穿透性,从而增强抗菌性能。通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM),傅里叶红外(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR)光谱观测UCNPs表面上的有机基团,Zeta电位仪测定UCNPs的Zeta电位,并检测纳米复合材料的上转换光谱等物理表征。结果显示:TEM观察两种纳米粒子的尺寸分布非常均匀,UCNPs约为25 nm,硅烷化的UCNPs约为30 nm,硅烷层厚度为约2-3 nm,薄硅烷层在粒子表面清晰可见。新的Si-O-Si和Si-OH的特征峰出现,表明硅烷改性成功。此外,由于长碳链-CH2的特征峰的强度,也表明硅烷改性的成功。通过XRD检测Mn~(2+)对UCNPs的结构的影响。结果证实了纯六方相NaYF_4在将Mn~(2+)引入纳米晶体之后,UCNPs的晶体结构从六方相变为立方相。另外,随着Mn~(2+)掺杂比例的增加,可以发现晶面的衍射峰向大角度方向移动,进一步说明了Mn~(2+)掺杂的成功。实验三:检测UCNPsMn@Ce6@silane对单菌种生物膜的抗菌性能的影响。合成UCNPsMn@Ce6@silane纳米复合材料,与UCNPs@Ce6@silane对比,在980 nm NIR激发下,对三种单菌种口腔生物膜,进行细菌生物膜死/活染色,菌落形成单位(CFU)计数确定细菌存活率,进行MTT检测生物膜代谢活性,进行硫酸-苯酚法检测多糖产量等一系列实验。实验结果表明:单纯的NIR激发并不能有效的激活Ce6@silane的aPDT效应,而UCNPs的加入,使得实验组的三种单菌种细菌生物膜,在细菌菌落数、活性、多糖产量等方面比Ce6@silane都有显著降低(P0.05)。同时,随着Mn~(2+)掺杂比例的增加,UCNPsMn@Ce6@silane的抗菌性可见显著提高,其中掺杂30%Mn~(2+)组表现出最佳的抗菌能力。这可能是由于硅烷化表面使UCNPs@Ce6的亲水性增强,而Mn~(2+)的加入使得上转换红光效应增强,提高了aPDT抗单菌种生物膜的能力。实验四:研究UCNPsMn@Ce6@silane对口腔多菌种细菌生物膜抗菌性能的影响。研究其对单菌种、三菌种、六菌种口腔生物膜的抗菌性能。选取Ce6@silane(对照组),UCNPs@Ce6@silane以及UCNPs30%Mn@Ce6@silane为实验组。通过细菌生物膜死/活染色,菌落形成单位(CFU)计数确定细菌存活率,MTT测定生物膜代谢活性,硫酸-苯酚法检测多糖产量等一系列实验检测其抗菌性能。结果表明UCNPs@Ce6@silane虽然可以在单菌种生物膜中表现较好的抗菌性能,但是在三菌种、六菌种生物膜中,其抗菌性能明显下降。然而在UCNPs30%Mn@Ce6@silane组,由于Mn~(2+)红光增强效应,导致Ce6的aPDT效应增大,因此对多菌种生物膜依然保持了较强的抗菌活性。综上,本论文利用UCNPs与红光光敏剂Ce6结合,同时通过掺杂Mn~(2+)提高UCNPs上转换红光的发光效率,进而增强Ce6的抗菌作用,最终通过硅烷化的表面处理,提高材料的亲水性以增加材料的生物可吸收度,通过aPDT研究其对口腔生物膜的影响。本实验的研究结果表明,新兴的基于上转化纳米粒子的抗菌光动力治疗,可以有效抑制口腔种植体周围炎症相关细菌生物膜的形成与发展,且毒性较低,具有较高的生物可利用度,这种新型的设计对临床治疗种植体周围炎提供了新的思路,为上转换纳米粒子的临床治疗提供了理论基础和实验支撑。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.6
【图文】：

口腔细菌,炎症,生物膜,牙齿

gingivalis表面的一些结构，能够促进细菌在龈下粘附、定植和生长，多种子以及代谢产物引起了种植体周围的组织破坏，并使机体产生了免疫防御在种植体周围炎的发生、发展过程中起到了重要作用。P. intermedia能够吸收，抑制新骨的形成，破坏牙槽骨代谢的作用，并且能够通过各种蛋白低宿主的防御能力。Robitaille N 等学者[26]通过 Meta 分析，总结了 21 篇文章，发现种植炎有多种细菌聚集在生物膜上，细菌的大量聚集加重了疾病的进程。生物菌迁移率差异，可能是造成种植体周围炎炎症加重的因素之一。然而导致衡破坏的发病机制和详细途径仍然在研究之中。

能级跃迁,单线,激发光,机制

1.3 抗菌光动力疗法的全身抗菌应用1.3.1 在慢性伤口感染的应用慢性的伤口感染有相当高的发病率，甚至会导致截肢。伤口感染从最初的细菌定植开始，随后是生物膜形成，生物膜保护细菌免受宿主防御，同时增加对常规抗生素的耐药性[83]。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌是最见的细菌，其他常见生物包括阴沟肠杆菌，粪肠球菌，铜绿假单胞菌，马氏链球菌等[84]。目前，治疗感染的最佳方式是去除细菌生物膜，研究表明 aPDT 可有效的治疗由各种病原体引起的伤口感染[85]。

多糖,细胞毒性,生物膜,方差分析

确定生物膜中多糖的量。在 OD 读数转换为多糖浓 0, 5, 10, 20, 50 和 100 mg/mL 作为标准。分析素 ANOVA 方差分析，评估显著差异(p < 0.05)。统SS, Chicago, IL)软件进行。果度的 Ce6 对小鼠成纤维细胞 L929 细胞毒性的

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