正畸驱动的骨皮质切开术对巨噬细胞的作用及机制研究

发布时间：2020-08-09 01:43

【摘要】：目的:通过建立骨皮质切开术加速牙移动动物模型,研究巨噬细胞在骨皮质切开介导的正畸牙移动加速进程中的作用及机制,为巨噬细胞调控正畸牙移动提供新的证据。材料与方法:将8周龄雄性Wistar大鼠及8周龄成年雄性C57BL/6小鼠随机分成实验组(CO+TM),对照组(TM)和空白组。分别对实验组,对照组大、小鼠上颌左侧第一磨牙实施正畸加力,同时对实验组同期行骨皮质切开术。分别在第3 d,5 d,7 d,14 d,21 d,28 d,42 d七个时间点收取大鼠,第5 d,7 d,14 d,21 d四个亚组收取小鼠。取上颌骨行Micro-CT检查,测量牙齿移动距离及移动牙周围骨密度改变。通过免疫组化染色技术观察大鼠牙周形态学改变、破骨细胞及巨噬细胞浸润。取大鼠移动磨牙腭侧牙龈,通过RT-PCR检测巨噬细胞数量以及极性分化标志物mRNA表达水平,并通过流式细胞术检测巨噬细胞极性分化。随后通过注射氯膦酸盐建立巨噬细胞清除模型,进一步验证巨噬细胞的作用。通过牙周组织与骨髓源性巨噬细胞共培养,RT-PCR检测巨噬细胞极性分化改变,Western blot检测巨噬细胞极化相关蛋白p65以及STAT3磷酸化水平。结果:1.骨皮质切开术显著加速大鼠牙齿移动距离与速率:在牙齿移动第5天到第42开,实验组的移动距离显著高于对照组并具有统计学差异。牙齿移动初期(第3天)牙齿移动速率最大,且对照组高于实验组,而后两组大鼠移动速率开始降低,直至第14天,为速率变化的转折点,其后移动速率又开始提高。第21天时,实验组的移动速率明显高于对照组。我们通过骨密度测量发现,实验组骨密度在牙移动的第3、7、14、28天均显著低于对照组。2.骨皮质切开术促进牙移动中牙周组织中破骨细胞和巨噬细胞的增加:通过TRAP染色发现,在第14天左右破骨细胞数量达顶峰,且实验组显著高于对照组。通过免疫组化染色发现,从第5天到第42天,实验组大鼠移动牙压力侧棕黄色的CD11b阳性细胞阳性率显著高于对照组;而实验组压力侧棕黄色的CD68阳性细胞阳性率则在第5-14天时显著高于对照组。通过RT-PCR检测发现CD68和CD11b基因在实验组和对照组的表达变化趋势基本一致。但实验组CD68和CD11b基因的表达量在第5-21天显著高于对照组。同时,流式细胞术检测分析显示实验CD11b~+细胞阳性率从第5天到第21天始终高于对照组。3.骨皮质切开术促进牙移动中巨噬细胞的极化:通过免疫组化染色显示,从第5天到第21天,实验组大鼠移动牙压力侧棕黄色的CD86显著高于对照组(TM);同时,除第14天外实验组压力侧棕黄色的CD163阳性细胞率也显著高于对照组。流式细胞术检测分析显示实验组CD11b~+CD86~+细胞阳性率从第5天到第21天始终高于对照组,而实验组CD11b~+CD163~+细胞阳性率除第14天外都显著高于对照组。通过RT-PCR检测发现实验组和对照组CD86基因的表达量在第5天到第14天呈逐步上升趋势,且实验组显著高于对照组。而实验组与对照组在CD163基因的表达量上趋势基本一致,且实验组CD163基因的表达量除第42天均显著高于对照组。与CD86基因表达量相一致的是,炎症型巨噬细胞相关因子IL-1β及TNF-α的基因表达量在牙移动早中期第5天和第14天时即显著性的高于对照组;而修复型巨噬细胞相关因子Arg-1及CD206表达量在牙移动早期第5天时和第21天时显著高于对照组。4.巨噬细胞清除抑制了骨皮质切开术引起的牙齿加速移动:在巨噬细胞清除模型中,与对照组相比,巨噬细胞清除组循环来源的单核细胞降低了70%,且巨噬细胞清除组牙龈组织中CD11b~+F4/80~+细胞阳性率也明显降低,其中,CD86~+和CD206~+细胞阳性率也明显降低。我们进一步通过Micro-CT观察了小鼠牙齿移动的基本情况。实验组的移动距离在第5天到第21天均显著大于对照组,而该移动距离增加的现象则在巨噬细胞清除后明显降低,同时,在巨噬细胞清除后,巨噬细胞清除组第5天到第14天中牙移动速率显著低于骨皮质切开组。5.骨皮质切开术通过NF-κB及JAK-STAT信号通路调控巨噬细胞极化分型:通过对小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)给予新鲜牙龈组织悬液刺激并运用RT-PCR分析巨噬细胞分型情况,结果显示,炎症型巨噬细胞相关因子TNF-α及IL-1β的基因表达量在牙移动早中期第5天和第14天时即显著性的高于对照组,随后开始下降。而修复型巨噬细胞相关因子Arg-1及CD206表达量在牙移动早期第5、14和21天时显著高于对照组且实验组两种目的基因的表达量总体趋势基本一致,即在第5天时表达增高而后第14天时开始下降直到第21天再次回升。通过western blot对巨噬细胞分析发现,与对照组相比,骨皮质切开组p65蛋白表达量在刺激第5-7天时显著增高。同时,磷酸化的STAT3蛋白表达量在第5天时显著高于对照组,而后开始下降,并在第21天时再次增高并显著高于对照组。结论:骨皮质切开术可以促进局部微环境中巨噬细胞的募集并极化改变,进而加速正畸牙移动,其中NF-κB及JAK-STAT信号通路的激活在巨噬细胞极化中发挥重要作用。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R783.5
【图文】：

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切口长约3 mm，穿透牙龈，深达骨膜下1 mm。每日使用生理盐水冲洗上颌磨牙并24h监控大小鼠口内的加力装置，若有损坏或脱落，及时重新安装。图1 动物模型示意图A图：左上颌第一磨牙加载正畸加力装置；B图：箭头所示为第一磨牙近远中切口；C图：箭头所示为预实验翻瓣后所见的切口2.4体内清除巨噬细胞动物模型的建立实验组小鼠再随机分为两组（5-6只/组）：氯膦酸盐清除组（CO + TM + LEC）和对照组（CO + TM）。氯膦酸盐清除组小鼠从牙移动的前一天开始每隔4天通过眼球后静脉丛注射氯膦酸盐以清除巨噬细胞，建立巨噬细胞清除模型，对照组小鼠则注射PBS做对照[37]。在巨噬细胞清除组中建立骨皮质切开加速正畸模型，并于术后 5、7、14、21 d处死（图2）。

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南京医科大学硕士学位论文18图2 体内清除巨噬细胞动物模型的建立2.5样本采集所有大小鼠分别在预定加力截止当天注射过量麻药后颈椎脱位处死。采集移动磨牙的腭侧牙龈，用于RT-PCR分析（5-6只/组）和流式细胞术检测（5-6只/组）。同时取移动磨牙的腭侧牙龈（6只/组），加入含1% FBS的DMEM培养液中，用研磨法制成单细胞悬液后，无菌条件下0.22μm过滤器过滤后得无菌牙龈组织溶液。同时将上颌骨完整取出，4%多聚甲醛固定48 h后，进行Micro-CT扫描分析及组织学检测。2.6骨髓源性巨噬细胞细胞的分离培养和刺激用DMEM完全培养基(含10% FBS)于37°C、5%的CO2孵箱中培养L929细胞3~ 5 d，然后收集细胞上清，无菌条件下0.22μm过滤器过滤后备用。（1）断颈处死雄性 4 周龄 C57BL/6 小鼠，投入 75%酒精中浸泡 3-5 分钟

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CD86+和 CD206+细胞阳性率也明显降低（图6F，6G）。我们进一步通过 Micro-CT 观察了小鼠牙齿移动的基本情况。实验组的移动距离在第 5 天到第 21 天均显著大于对照组（图 6H，6I），而该移动距离增加的现象则在巨噬细胞清除后明显降低，同时，在巨噬细胞清除后，巨噬细胞清除组第 5 天到第 14 天中牙移动速率显著低于骨皮质切开组（图 6J）。结果提示巨噬细胞在骨皮质切开术加速正畸牙移动中发挥了重要作用。

【参考文献】