CDH12对涎腺腺样囊性癌细胞侵袭能力的影响

发布时间：2020-08-11 09:22

【摘要】：目的探讨CDH12基因对涎腺腺样囊性癌细胞(SACC)侵袭能力的影响。方法应用巢式RT-PCR法从涎腺腺样囊性癌高转移细胞株SACC-M的总RNA中扩增出CDH12cDNA;应用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建含人CDH12基因的重组腺病毒表达载体;转染SACC-M细胞后,采用Western blot检测CDH12蛋白分子的表达,采用侵袭小室法检测CDH12对SACC-M细胞侵袭能力的影响。结果 CDH12基因重组腺病毒及空腺病毒经鉴定正确;Western blot检测发现,CDH12基因重组腺病毒转染细胞(Ad-CDH12/SACC-M)组CDH12的表达水平明显高于空腺病毒载体转染(Ad0/SACC-M)对照组;与Ad0/SACC-M组相比,Ad-CDH12/SACC-M组细胞的侵袭能力明显高于Ad0/SACC-M组(P0.01)。结论 CDH12能够促进涎腺腺样囊性癌细胞的体外侵袭能力,提示该基因在涎腺腺样囊性癌的侵袭转移中可能具有重要意义。
【图文】：

Gold 感受态菌大量扩增，腺病毒质粒 pAd-CDH12及 pAd0 转染 AD-293 细胞后会发生 CPE，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白（图 3），说明 CDH12 基因重组腺病毒 Ad-CDH12 及空腺病毒 Ad0 包装成功。2.3 Western blot 鉴定 N-cadherin 的表达Western blot 检测结果显示，感染 Ad-CDH12 和Ad0 的 SACC-M 细胞裂解物中均可见到 140 kDa 左右的 N-cadherin 带。感染 Ad-CDH12 组表达水平比（N-cadherin/tubulin）明显高于感染空腺病毒载体的Ad0 组，说明腺病毒载体能很好地表达 CDH12 蛋白。见图 4。2.4 CDH12 对 SACC-M 细胞侵袭能力的影响BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber 已经重建了基底膜胶，在聚碳酸脂膜表面形成类似天然基底膜的结构，细胞侵袭穿过重建基底膜胶的能力可反映该细胞的侵袭能力。Ad-CDH12/SACC-M 组 48 h后穿过侵袭小室聚碳酸脂膜的细胞数 （88.00±9 . 70）明显多于 Ad0/SACC-M 组（42.80±4.92）（P ＜0.01），说明 Ad-CDH12/SACC-M 细胞的侵袭能力明显增强。见图 5。M，BM5000 DNA marker；1

化后转化 BJ5183 感受态菌，在 BJ5183 中与腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 发生同源重组，Pac Ⅰ酶切鉴定获得正确的腺病毒质粒（图 2），将其转化 XL 10-Gold 感受态菌大量扩增，腺病毒质粒 pAd-CDH12及 pAd0 转染 AD-293 细胞后会发生 CPE，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白（图 3），说明 CDH12 基因重组腺病毒 Ad-CDH12 及空腺病毒 Ad0 包装成功。2.3 Western blot 鉴定 N-cadherin 的表达Western blot 检测结果显示，感染 Ad-CDH12 和Ad0 的 SACC-M 细胞裂解物中均可见到 140 kDa 左右的 N-cadherin 带。感染 Ad-CDH12 组表达水平比（N-cadherin/tubulin）明显高于感染空腺病毒载体的Ad0 组，说明腺病毒载体能很好地表达 CDH12 蛋白。见图 4。2.4 CDH12 对 SACC-M 细胞侵袭能力的影响BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber 已经重建了基底膜胶，在聚碳酸脂膜表面形成类似天然基底膜的结构

基因两端引入 Nhe Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切位点。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约 2.7 kb 处可见 1 明亮条带，与目的片段大小一致（图 1）。目的基因与 T 载体连接后，经测序证实与 GenBank 登录的人 CDH12基因序列一致。2.2 CDH12 重组腺病毒表达载体的鉴定测序正确的重组子 pMD18T-CDH12 经 Nhe Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切后，将 CDH12 亚克隆至腺病毒穿梭载体 pShuttle-IRES-hrGFP-1，然后经 Pme I 线性化后转化 BJ5183 感受态菌，在 BJ5183 中与腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 发生同源重组，Pac Ⅰ酶切鉴定获得正确的腺病毒质粒（图 2），将其转化 XL 10-Gold 感受态菌大量扩增，腺病毒质粒 pAd-CDH12及 pAd0 转染 AD-293 细胞后会发生 CPE

【参考文献】

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本文编号：2788892