木通皂苷D对人牙周膜干细胞生物学特性的影响及其相关机制的研究

发布时间：2020-08-11 09:32

【摘要】：牙周膜干细胞(peridontal ligament stem cells,PDLSCs)是从人的牙周膜中分离出来的具有多向分化潜能的一种间充质干细胞,属前体干细胞的一种,可分化为成骨样细胞、成纤维细胞以及成牙骨质样细胞,在牙体、牙周组织发育以及组织再生修复中起重要作用。人牙周膜干细胞最早是于20世纪80年代初从人体牙周膜中分离获取的,Seo等人研究证实,牙周膜内存在具有多向分化潜能的干细胞—牙周膜干细胞,属于成体干细胞的一种,能产生特定表型和功能的成熟细胞,并在组织损伤、修复中发挥重要作用。近年来,因其在体外微环境刺激下可分化成为成骨细胞、成牙骨质细胞以及成纤维细胞等,成为口腔领域的一种新兴干细胞,被认为是牙周组织再生的理想种子细胞。木通皂苷D(Akebia saponin D,ASD)是中国传统中草药材续断、木通的活性成分,又被称作续断皂苷IV,ASD具有明确药理活性,近年来主要用于制备促进骨折愈合和治疗骨质疏松的药物,其临床效果安全可靠,对人体没有明显的毒副作用。程志安、张云辉等人分别通过体外实验研究表明,木通皂苷D可明显促进成骨细胞与大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖与分化潜能,ASD显著提高了成骨细胞的活性,促进其钙化,从而达到促进骨折愈合防治骨质疏松的效果。Yes相关蛋白(Yes-associatedprotein,YAP)是一种协同转录因子,YAP可穿梭于细胞质与细胞核之间,其本身并不包括任何DNA结构域,但它在各种生物中具有高度保守的ww结构域,能够识别结合富含脯氨酸的序列,增强蛋白与蛋白之间的作用,YAP在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡以及维持细胞干性等过程中起着重要作用。YAP进入细胞核,与相应的富含脯氨酸的转录因子结合以共同启动其下游目的基因的转录,当下游基因被激活后,其主要功能是抑制细胞的凋亡和促进细胞的增殖。有研究表明,在肝脏内过表达YAP基因,能够明显促进其增殖,而大大增加了肝脏的体积。近年来的研究表明,YAP对干细胞的增殖以及分化具有调节作用,在胚胎干细胞以及神经干细胞中过表达YAP可促进其增殖,增强其自我更新能力;而在异常病理状态下,对YAP起抑制作用的作用因子减弱就会导致细胞增殖能力异常升高,使细胞凋亡不足,从而引起肿瘤的发生。目的:本研究是通过在体外培养人牙周膜干细胞的基础上,观察木通皂苷D对人牙周膜干细胞细胞凋亡、细胞周期、表型维持及细胞增殖等生物学行为的影响,并对其相关机制进行初步探究。方法施1.分离培养人PDLSCs:应用组织块法从12～18岁因正畸治疗需要而拔除的健康的第一、二前磨牙上分离培养人PDLSCs,取3～6代生长状态良好的细胞进行后续实验。2.细胞凋亡检测:经细胞凋亡试剂盒PI染色后,通过流式细胞术检测ASD对人PDLSCs凋亡的影响。3.细胞周期检测:应用细胞周期试剂盒PI染色后,通过流式细胞技术检测ASD对人PDLSCs细胞周期的影响。4.表面干性检测:应用实时定量PCR技术检测ASD对人PDLSCs表面干性维持相关因子Scleraxis、Col-I的表达情况。5.增殖能力检测:应用实时定量PCR技术检测ASD对人PDLSCs增殖相关基因PCNA、Ki67、CyclinD1 的影响。6.ASD对人PDLSCs增殖机制的研究:通过转染小干扰RNA靶向抑制人PDLSCs内YAP基因的表达,通过实时定量PCR检测转染效率,并通过定量PCR观察ASD对增殖影响的变化。7.统计学分析:实验所有数据均采用SPSS19.0分析软件进行分析,将P0.05视作具有统计学意义。结果:1.应用组织块法成功分离培养出生长状态良好的人PDLSCs。2.流式细胞术检测凋亡的结果表明相对于阴性对照组,ASD对人PDLSCs的凋亡无明显影响,其结果具有统计学意义(P0.05)。3.流式细胞术检测细胞周期表明相对于阴性对照组ASD组可明显促进人PDLSCs的细胞增殖,其结果具有统计学意义(P0.05)。4.实时定量PCR显示表面干性相关因子Scleraxis的表达有所提高,但Col-I无明显的变化。5.实时定量PCR显示,增殖相关因子Ki67、CyclinD1的表达发生了显著增加,PCNA表达变化较小,其结果具有统计学意义(P0.01)。6.通过转染shRNA可有效降低PDLSCs中YAP基因的表达,其结果具有统计学意义(P0.01)。7.降低PDLSCs中YAP基因的表达后,ASD不再能促进PDLSCs的增殖,其结果具有统计学意义(P0.01)。结论:1.组织块法可用于人PDLSCs的分离及培养,可得到生长状态良好的人PDLSCs。2.与阴性对照组相比,ASD对人PDLSCs无明显的细胞毒性。3.ASD可促进人PDLSCs的细胞增殖,促进细胞进行有丝分裂。4.ASD可促进表面干性相关因子Scleraxis的表达,但是对Col-I的作用不明显。5.ASD对人PDLSCs的增殖有明显的促进作用,可明显促进增殖相关基因Ki67、CyclinD1的表达,以加入木通皂苷D24h,其增殖基因Ki67、CyclinD1的表达达到最高,随时间的延长,其表达量有所降低;较明显的促进PCNA的表达,其变化量随加药时间的延长变化较小。6.通过转染小干扰RNA可效靶向降低人PDLSCs内YAP基因的表达,转染效率高。7.ASD促进PDLSCs的增殖可能与YAP基因有关。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78
【图文】：

图１倒置显微镜下ＰＤＬＳＣｓ观察图片逡逑Ａ：原代细胞，７ｄ左右单个牙周膜细胞开Ｂ：原代细胞１４ｄ左右大量细胞从组织块Ｃ：Ｐ２细胞，当细胞扩增繁殖到一定数量时细胞均一性好，生长状态良好。逡逑Ｆｉｇ邋１．邋ＰＤＬＳＣｓ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｕｎｄｅｒ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉＡ：邋Ａｆｔｅｒ邋７邋ｄａｙｓ邋，邋ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ邋ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ邋ｍｅｍｂｓｈｏｗｉｎｇ邋Ａ邋ｓｐｉｎｄｌｅ邋ｓｈａｐｅ．逡逑Ｂ：邋Ａｂｏｕｔ邋１４邋ｄａｙｓ，邋ａ邋ｌａｒｇｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ邋ｅｘｐａａ邋ｓｉｎｇｌｅ邋ｓｈａｐｅ邋ａｎｄ邋ａ邋ｇｏｏｄ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｓｔａｔｅ．逡逑Ｃ：邋Ｗｈｅｎ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｒｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ａｎｄ邋ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｂｅ邋ｓｅｅｎ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｇｒｏｗ邋ｉｎ邋ａ邋ｓｐｉｎｄｌｅ邋ｓｈａｐｅ邋ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｓｔａｔｕｓ．逡逑

图２邋ＡＳＤ对细胞凋亡的影响逡逑人ＰＤＬＳＣｓ经ＰＩ染色后，流式细胞术检测ＡＳＤ对细胞凋亡的影响逡逑图Ａ：阴性对照组逡逑图Ｂ：逦ＡＳＤ处理组逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ逡逑Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ａｆｔｅｒ邋ＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＤＬＳＣｓ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ａ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｂ：邋ＡＳＤ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｇｒｏｕｐ逡逑

图３邋ＡＳＤ对细胞周期的影响逡逑人ＰＤＬＳＣｓ经ＰＩ染色后，流式细胞术检测ＡＳＤ对细胞周期的影响逡逑图Ａ：阴性对照组逡逑图Ｂ：邋ＡＳＤ处理组逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ逡逑Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ａｆｔｅｒ邋ＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＤＬＳＣｓ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ａ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｂ：邋ＡＳＤ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｇｒｏｕｐ逡逑

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本文编号：2788903