成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞黏附与迁移作用的影响

发布时间：2020-08-12 14:53

【摘要】：目的纯化的人颅骨成骨细胞为阳性靶细胞,以牙龈成纤维细胞为吸附对照细胞从噬菌体十二肽库中筛选出能与之特异性结合的多肽,即为成骨细胞特异性识别多肽,其氨基酸序列为:VLAVPWSEPGYL。本研究意在探讨该多肽对人颅骨成骨细胞黏附及迁移作用的影响,并确定该多肽体外促进人颅骨成骨细胞迁移及黏附的最佳浓度,为该多肽的进一步研究提供实验基础。具体内容及结果如下:1.细胞黏附实验检测特异性识别多肽对人颅骨成骨细胞黏附作用的影响体外常规培养人成骨细胞,用条件培养液分别稀释成骨细胞特异性识别多肽,使其浓度分别为 10-4mol/L 组、10-5mol/L 组、10-6mol/L 组、10-7mol/L 组、10-8mol/L组,及空白对照组。分别于相应时间点(0.5h,1h,2h,4h,8h)吸弃培养基,采取体视学的方式,显微镜下计算随机视野内黏附的细胞数。每组计算6个视野区,统计每组的平均值(细胞数/mm2)进行统计学分析。结果:在此浓度范围内,成骨细胞特异性识别多肽对人颅骨成骨细胞黏附具有一定促进作用,其最佳有效作用浓度是10-5mol/L(P0.05)。2.细胞划痕修复实验及Transwell迁移实验检测成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞迁移作用的影响2.1.细胞划痕修复实验体外常规培养人颅骨成骨细胞,不含多肽的无血清培养基作为对照组,实验组分为10-4、10-5、10-6 10-7、10-8mol/L五个多肽浓度组。用消毒的2ul枪头在铺满单层细胞的六孔板底表面缓慢轻柔地划出一条笔直痕迹,分别在0,24,48小时拍照观察细胞的相对划痕愈合面积(=迁移前划痕的面积-迁移后划痕的面积),以24小时划痕愈合面积作为统计学计算标准进行统计学分析。结果:实验组各浓度组与对照组之间24h划痕愈合面积的差异均有统计学意义(F=75.87,P0.05),与对照组及其余实验组相比,10-4mol/l与10-5mol/l组细胞划痕愈合面积均显著增加(P0.05)2.2Transwell迁移实验体外培养人颅骨成骨细胞,实验分为六组,即空白对照组、10-4mol/L组、10-5mol/L 组、10-6mol/L 组、10-7mol/L 组、10-8mol/L 组。采用 transwell 小室(24孔,孔径8.0um,聚碳酸酯膜厚度6.5mm),上室加入1×105个/ml含1%血清的细胞悬液100ul,下室按照实验分组加入含不同浓度多肽的含30%血清培养液600ul,空白对照组加入不含多肽的含30%血清培养液600ul,72h后取出小室,对迁移至膜下细胞进行固定、染色、拍照、计数,统计学分析所获得的实验数据。结果:实验组各组细胞迁移数目均高于对照组,且差异有统计学意义(F=127.999,P0.05)。10-4mol/l 与 10-6mol/l 浓度组间差异无统计学意义(F=0.25,P0.05)。综上,一定浓度范围的特异性识别多肽可促进成骨细胞的黏附与迁移,且10-5mol/l浓度的促进作用最为显著。3.Transwell迁移实验检测特异性识别多肽对人牙龈成纤维细胞及人骨髓基质细胞迁移作用的影响。体外培养人牙龈成纤维细胞及人骨髓基质细胞,实验分为六组,即空白对照组、10-4mol/L 组、10-5mol/L 组、10-6mol/L 组、10-7mol/L 组、10-8mol/L 组。采用transwell小室(24孔,孔径8.0um,聚碳酸酯膜厚度6.5mm),上室加入1×105个/ml含1%血清的细胞悬液100ul,下室按照实验分组加入含不同浓度多肽的含10%血清培养液600ul,空白对照组加入不含多肽的含10%血清培养液600ul,24h后取出小室,对迁移至膜下细胞进行固定、染色、拍照、计数,获得的实验数据进行统计学分析。结果:在此浓度范围内,成骨细胞特异性识别多肽对人牙龈成纤维细胞迁移具有一定抑制作用,对人骨髓基质细胞迁移具有一定的促进作用。结论成骨细胞特异性识别多肽能够促进成骨细胞黏附及迁移。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R783
【图文】：

形态图,倒置显微镜,形态,间充质细胞

培养液浑浊可见相当一部分细胞悬浮于培养液中，未贴壁生长，细胞贴壁逡逑生长率约６０％。培养２４－４８ｈ后倒置显微镜观察，可见细胞伸展，恢复梭形或纺锤逡逑形正常外观，细胞较小，胞突较短，有数目不等、长短不同的胞质突，见图２Ａ。逡逑培养３－４天后倒置显微镜下观察细胞呈梭形或纺锤形，有多个较长的细胞突起逡逑（２－４个），胞浆丰满、均匀，核呈卵圆形或圆形，有１－３个核仁，核仁清晰可见，逡逑见图２Ｂ。逡逑？邋．邋？邋＇邋．邋■邋．逡逑八，逦■逦－逡逑■＇邋－ｖ：－邋■；邋■＇邋■逡逑■逡逑NB．．邋ｍ二逦＇邋＇＾：逡逑；Ａ逦Ｂ逡逑？…．、：、二＇Ｋ．．逦■逡逑，．逦Ｖ．、，、逦，逦■逦１邋１逦，逡逑图２倒置显微镜下观察人牙龈成纤维细胞形态逡逑Ａ：邋ｘ４0；邋Ｂ：邋ｘ４0逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＣＧ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｐｈａｓｅ邋ｃｏｎｔｒａｓｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．逡逑Ａ：邋ｘ４0；邋Ｂ：ｘ４0逡逑３．邋１．３．体外培养人骨髓间充质细胞的形态学观察逡逑人骨髓间充质细胞购回当天

形态图,倒置显微镜,间质细胞,形态

培养液浑浊可见相当一部分细胞悬浮于培养液中，未贴壁生长，细胞贴逡逑壁生长率约７０％。４８小时观察细胞伸展恢复梭形外形，细胞贴壁增加，仍有少许逡逑细胞悬浮于培养液屮，见图３邋Ａ。３天换液后倒置显微镜观察，细胞基本铺满培养逡逑皿底上，细胞形态成梭形、角状，细胞生长力旺盛，密集分布，见图３Ｂ。逡逑２０逡逑

质谱分析,多肽,特异性识别

３．邋２不同浓度成骨细胞特异性识别多肽的配制逡逑课题组采用的成骨细胞特异性识别多肽，要求纯度达到９８％以上，由生产方（上逡逑海科肽生物科技有限公司）使用ＨＰＬＣ和质谱进行鉴定，见图４。该多肽按２０ｍｇ每逡逑瓶进行分装，离心后以无水乙醇溶解后，溶液澄清透明。无水乙醇多肽溶液融入逡逑含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液中，充分吹散混匀至培养液内无结晶物质。逡逑ｎＶ逡逑－、…逡逑１８００逦Ｉ逡逑！＜￥００逡逑１４００逡逑１２００逡逑１ＣＯＯ逡逑８００逡逑ｔｏｏ逡逑ＪＯＯ逡逑２：：逦Ｉ．逦§逡逑ｔ逦ＪＵ逦逦邋．．．ｊ逦逡逑＾＾逦ｊｉ逦ｓ逦逦ＩＡ逦ｌｉＳ逦ＬＡ逦ｇａｉｎ逡逑图４邋ＶＬＡＶＰＷＳＥＰＧＹＬ质谱分析报告逡逑Ｆｉｇ４邋Ｔｈｅ邋ｍａｓｓ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｐｏｒｔ邋ｏｆ邋ＶＬＡＶＰＷＳＥＰＧＹ逡逑２１逡逑

【参考文献】