口腔鳞癌肿瘤相关成纤维细胞外泌体中miR-188-5p调控PTEN促进细胞迁移和侵袭

发布时间：2020-08-13 08:08

【摘要】：目的口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面-头颈部最常见的恶性肿瘤之一,OSCC恶性程度高,5年生存率低[1]。易发生转移是OSCC不良预后的主要原因之一,因此,OSCC转移的预防和治疗是临床和基础研究亟待解决的问题之一。既往关于OSCC转移机制的研究多关注OSCC细胞本身的迁移和侵袭能力,而研究证明不止是肿瘤细胞的遗传学改变,肿瘤细胞与局部微环境相互作用与肿瘤的发生发展及转移亦密切相关。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中最主要的间质细胞之一,与肿瘤发生发展与转移密切相关。PTEN是重要的抑癌基因,参与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。本研究的目的是探讨CAFs调控OSCC细胞中PTEN表达的机制及其在OSCC细胞迁移和侵袭中的作用。实验方法1.探讨CAFs是否调控OSCC细胞迁移和侵袭应用组织块法从OSCC组织和癌旁正常组织中分离培养成纤维细胞,应用α-SMA标记CAFs;将CAFs与癌旁正常组织中成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)分别与口腔鳞状细胞癌细胞系CAL-27细胞共培养,应用transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力,以验证CAFs是否调控CAL-27细胞迁移和侵袭。2.探讨CAFs如何调控CAL-27细胞迁移和侵袭分离CAFs和NFs细胞条件培养基中外泌体,分别应用两种外泌体培养CAL-27细胞,transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力;分别提取两种外泌体中RNA,反转录后应用实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-382-5p表达,比较两种外泌体中miR-382-5p表达量;敲除CAFs中miR-382-5p,将敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs与CAL-27细胞共培养,应用transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力,以验证CAFs是否通过miR-382-5p调控CAL-27细胞迁移和侵袭;将荧光标记的miR-382-5p转染至CAFs,并将其与CAL-27细胞共培养,加入外泌体分泌抑制剂,检测miR-382-5p是否通过外泌体途径被转运至CAL-27细胞。3.探讨miR-382-5p调控CAL-27细胞迁移和侵袭的机制在 CAL-27 细胞中转染 miR-382-5p inhibitors,检测 CAL-27 细胞中 PTEN表达;在敲除 PTEN 的 CAL-27 细胞中转染 miR-382-5p inhibitors,应用 transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力,以验证miR-382-5p是否通过调控PTEN影响CAL-27细胞迁移和侵袭;构建PTEN 3'-UTR活性报告基因,将报告基因转染至CAL-27细胞中,检测转染miR-382-5p后PTEN 3'-UTR报告基因活性;突变报告基因上miR-382-5p识别位点,检测突变后是否能够阻断miR-382-5p对报告基因活性的调控作用。结果1.应用组织块法从OSCC组织和癌旁正常组织中分离培养成纤维细胞,免疫细胞化学染色显示,OSCC组织中成纤维细胞为α-SMA染色阳性,而癌旁正常组织中成纤维细胞为α-SMA染色阴性,Western blot结果亦显示OSCC组织中成纤维细胞α-SMA表达量明显高于癌旁正常组织中α-SMA表达量,提示OSCC组织中成纤维细胞为CAFs。将NFs与CAFs分别与CAL-27细胞共培养,transwell实验显示,与NFs相比,CAFs能够明显促进CAL-27细胞迁移和侵袭。2.分离CAFs和NFs培养基中外泌体,分别用于培养CAL-27细胞,transwell实验显示CAFs来源的外泌体较NFs来源的外泌体培养的CAL-27细胞表现出更强的迁移和侵袭能力。提取CAFs和NFs来源的外泌体中RNA,qRT-PCR实验发现CAFs外泌体中miR-382-5p表达量明显高于NFs。将敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs与CAL-27细胞共培养,transwell实验结果显示,敲除miR-382-5p后,共培养的CAL-27细胞迁移和侵袭能力明显减弱。将荧光标记的miR-382-5p转染至CAFs,并将其与CAL-27细胞共培养,发现miR-382-5p能够进入CAL-27细胞中,加入外泌体释放抑制剂能够明显阻断miR-382-5p 由 CAFs 进入 CAL-27 细胞。3.在 CAL-27 细胞中转染miR-382-5p inhibitors,检测 PTEN 表达,qRT-PCR和 Western blot 实验显示,miR-382-5p inhibitors 能够明显上调 PTEN mRNA 和蛋白表达。敲除PTEN能够明显逆转miR-382-5p inhibitors导致的细胞迁移和侵袭能力的减弱。构建PTEN3'-UTR报告基因,并突变报告基因上miR-382-5p识别位点,miR-382-5p能够明显下调PTEN 3'-UTR报告基因活性,而突变报告基因上miR-382-5p识别位点能够阻断miR-382-5p对PTEN 3'-UTR报告基因活性的调控作用。结论在本研究中,我们发现口腔鳞状细胞癌CAFs外泌体可以将miR-382-5p转移到口腔鳞状细胞癌细胞中,miR-382-5p抑制口腔鳞状细胞癌细胞中PTEN表达,从而影响口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭。本研究揭示了肿瘤微环境中CAFs调控口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的新机制,为靶向CAFs研发抗口腔鳞状细胞癌的药物提供了理论依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8
【图文】：

三、ＣＡＦｓ促进口腔淲状细胞癌细胞迁移和侵袭逡逑分别将ＣＡＦｓ和ＮＦｓ与口腔鳞状细胞癌细胞共培养，共培养体系懫用康宁逡逑公司细胞共培养板，如图１－５所示，上室（ｕｐｐｅｒ邋ｃｈａｍｂｅｒ）培养ＣＡＦｓ或ＮＦｓ，逡逑下室接种ＣＡＬ－２７细胞。逡逑１８逡逑

三、ＣＡＦｓ促进口腔淲状细胞癌细胞迁移和侵袭逡逑分别将ＣＡＦｓ和ＮＦｓ与口腔鳞状细胞癌细胞共培养，共培养体系懫用康宁逡逑公司细胞共培养板，如图１－５所示，上室（ｕｐｐｅｒ邋ｃｈａｍｂｅｒ）培养ＣＡＦｓ或ＮＦｓ，逡逑下室接种ＣＡＬ－２７细胞。逡逑１８逡逑

ＣＡＬ－２７细胞分为２组，ＮＦｓ－Ｃｏ组与ＮＦｓ共培养，ＣＡＦｓ－Ｃｏ组与，４８小时后，将两组ＣＡＬ－２７分别进行ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验，检测细胞迁力。图１－６显示，在ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞迁移实验中，ＣＡＦｓ－Ｃｏ组较ＮＦ多的细胞穿过ｔｒａｎｓｗｅｌｌ半透膜（ｎ＝６，邋／＾〈Ｏ．ＯＳ），提示与ＣＡＦｓＬ－２７细胞迁移能力较与ＮＦｓ共培养的ＣＡＬ－２７细胞迁移能力增ｅｌｌ细胞侵袭实验中，ＣＡＦｓ－Ｃｏ组较ＮＦｓ－Ｃｏ组有更多的细胞穿过ｔｒａｎ（ｎ＝６，户＜０．０５），提示与ＣＡＦｓ共培养的ＣＡＬ－２７细胞侵袭能力培养的ＣＡＬ－２７细胞迁移能力增强。逡逑ＮＦｓ－Ｃｏ逦ＣＡＦｓ－Ｃｏ逡逑

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