上皮根鞘在Vps4b基因敲除鼠牙根发育中的形态和增殖凋亡能力变化

发布时间：2020-08-13 13:05

【摘要】：背景和目的上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath,HERS)作为启动牙根的信号中心,在牙根发育中必不可少。牙根的正常生理过程与HERS完整的形成、适时的断裂及细胞增殖、凋亡密切相关。牙本质发育不良I型(Dentin dysplasia type I,DD-I)又称为根部牙本质发育不良,是一种牙根严重发育不良导致根短小、畸形的常染色体显性遗传病。细胞液泡分选蛋白4B(Vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)是一种多功能蛋白,在调控细胞增殖凋亡、溶酶体降解、细胞内蛋白转运等过程中起重要作用。本课题组前期对一个DD-I家系外周血全基因组测序发现该家系致病基因为VPS4B;并且研究表明VPS4B可能是影响牙齿发育的重要基因,但是其在牙根发育过程中的具体作用不是很清楚。本实验通过Vps4b基因敲除小鼠模型,观察HERS在牙根发育过程中的形态变化,分析该基因突变对HERS细胞增殖、凋亡能力的影响,进而探讨该基因在牙根致畸中的可能作用。材料与方法将Vps4b基因敲除小鼠雌雄合笼交配,记录出生后(Postnatal,P)时间。分别于P5天、P9天、P11天、P15天、P19天引颈处死解剖分离下颌第一磨牙区下颌骨和小鼠尾巴。新生幼鼠的基因型使用PCR技术进行鉴定。将幼鼠下颌骨采用4%多聚甲醛溶液固定、10%EDTA脱钙、石蜡包埋,制备切片,使用苏木精-伊红(Haematoxylin and eosin,HE)染色的方法确定各组小鼠牙根发育时期,免疫组织化学方法对不同时期HERS细胞内细胞角蛋白14(Cytokeratin14,CK14)、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)进行组织定位,对比野生小鼠和Vps4b基因敲除小鼠CK14、PCNA、Bcl-2蛋白表达的差异。结果PCR的检测结果显示子代小鼠基因型为正常型Vps4b~(+/+)和杂合型Vps4b~(+/-)两种。正常小鼠HE染色显示:小鼠P5天HERS形成,牙根发育开始;P9天HERS结构连续,根分叉结构形成;P11天HERS发生断裂;P15天根1/3开始形成;P19天牙根发达到生理性长度,HERS继续断裂,其末端保持完整。正常小鼠免疫组织化学染色结果:P5天,HERS形成双层细胞结构,HERS细胞PCNA阳性表达,Bcl-2无表达;P9天,HERS仍连续并继续延伸,HERS细胞PCNA强阳性表达,Bcl-2阳性表达;P11天,HERS开始发生断裂,HERS末端保持完整,牙颈部有少量细胞PCNA阳性表达,HERS末端部分PCNA强阳性表达,Bcl-2在HERS细胞中弱阳性表达;P15天,牙根表面很少见到PCNA阳性的HERS细胞,HERS末端PCNA仍强阳性表达,HERS细胞Bcl-2弱阳性表达;P19天,牙根发育基本完成,仅HERS末端PCNA阳性表达,Bcl-2阴性表达。Vps4b基因敲除后抗CK14蛋白显示HERS在P9天开始发生断裂,P15天以后HERS不连续,HERS细胞数量减少,并形成细胞簇附着在牙根表面;与正常小鼠相比,PCNA在HERS细胞中表达强度变弱(P0.05),HERS细胞仅在P9天、P11天Bcl-2呈阳性表达并且表达强度减弱(P0.05)。结论在Vps4b~(+/-)小鼠牙根发育过程中HERS的连续性过早中断,提示Vps4b基因的缺失影响HERS正常形态的形成。HERS细胞PCNA、Bcl-2的表达强度减弱,推测Vps4b可能通过调节HERS细胞的增殖、凋亡进而影响牙根的发育。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78
【图文】：

引物扩增,小鼠,条带,隐性

可扩增出一条 425bp条带，隐性纯合型无条带（如图 4.1）。图4.1 小鼠Vps4b gDNA扩增结果图：A. 以F1/R1为引物扩增出2条条带；B. 以 F1/R2 为引物扩增一条条带

牙根,HE染色,上皮根鞘,牙囊

图 5.2-1 各期牙根 HE 染色：A:P5 HERS 开始形成；B：P9 根分叉开始；C：P11 HERS开始断裂；D：P15，根 1/3 形成；E：P19 牙根基本发育完成。HERS：上皮根鞘；Am:成釉细胞；DP：牙乳头；DF：牙囊；Fur:根分叉结构。×40

牙根,基因敲除小鼠,上皮根鞘,免疫组化

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