生长因子FGF-2和VEGF对人牙周膜干细胞增殖、迁移、黏附及成骨分化能力的影响

发布时间：2020-08-16 20:55

【摘要】：牙周病作为一种慢性炎症破坏性疾病，被证明是引起成人牙齿缺失的首要致病因素，它主要累及牙槽骨、牙周膜及牙骨质等牙周支持组织。目前，牙周组织病损后的组织重建和再生仍是困扰牙周病治疗效果的主要瓶颈；近年来，组织工程技术的出现为牙周组织的再生和重建带来了希望。它包括三方面要素：支架材料、生长因子和种子细胞。其中，选择合适的种子细胞和生长因子，并确保后者对前者产生最佳的调控效果是其成功的关键。目前种子细胞种类繁多，如脂肪干细胞、骨髓基质干细胞、牙周膜干细胞、诱导多能干细胞等，其中，牙周膜干细胞（periodontalligament stem cells，PDLSCs）因组织来源相近和可向牙周膜方向分化等优势已成为牙周组织再生的首选种子细胞。在众多生长因子中，血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor，FGF-2）作为两种重要生长因子成为人们关注的焦点。FGF-2可促进间充质干细胞增殖，保持其多向分化能力。但其对干细胞成骨分化的作用存在争议，有报道称长期、大剂量的应用FGF-2可抑制成骨分化，但内源性FGF-2又对成骨分化起重要调节作用。VEGF可由间充质干细胞分泌，能增强脂肪干细胞多向分化能力，并可促进骨髓间充质干细胞的成骨及成血管分化，促进脐静脉内皮细胞增殖和迁移。此外，鉴于这两种因子较肯定的促间充质干细胞成血管分化能力，二者应用于PDLSCs是否可获得令人满意的促成骨分化效果，从而实现牙周骨和血管组织的同步再生就成为我们的关注点。本研究首次对这两种生长因子不同施加方式对牙周膜干细胞基本生物学特性的影响进行探讨。研究目的：将FGF-2和VEGF以不同施加方式作用于牙周膜干细胞，观察其增殖、迁移、黏附及成骨分化能力的变化，探究其促牙周再生作用机制，以期优化生长因子施加方式，获得更好的促牙周再生效果。研究方法： 1、牙周膜干细胞的原代培养，光学显微镜观察细胞外形及克隆形成情况，流式细胞仪进行干细胞表面分子标志物鉴定，定向诱导后成骨成脂染色验证其多向分化能力。 2、CCK-8法测细胞生长曲线，流式细胞仪测细胞周期，结合碱性磷酸酶活性定量检测确定两种因子促增殖、成骨分化最佳有效浓度。 3、CCK-8法测细胞生长曲线、划痕损伤愈合实验、细胞黏附实验观察其增殖、迁移、黏附能力变化。 4、碱性磷酸酶定性、定量检测，茜素红染色，real-time RT-PCR和western blot检测成骨相关基因和蛋白的表达情况，研究其成骨分化能力变化。 5、扫描电镜观察经两种因子预处理的PDLSCs在β-TCP和Bio-Oss骨粉材料表面的黏附、伸展情况，并植入裸鼠皮下(n=10)，8周后取材行组织学观察来评价其体内成骨能力。研究结果： 1、原代牙周膜干细胞贴壁生长，呈典型成纤维细胞样外形，并且具有一定克隆形成能力；细胞体外成骨成脂诱导后，出现明显矿化结节和脂滴；流式细胞仪显示细胞表达STRO-1、CD146、CD105、CD90，而不表达CD34、CD14。 2、CCK-8结果显示在2%血清浓度下，两种因子均未表现出明显促增殖效果；在10%血清浓度下，20μg/L FGF-2促增殖效果较突出；细胞周期结果显示10μg/LVEGF可明显升高处于活跃增殖期（S+G2M）的比例：碱性磷酸酶定量检测表明，20μg/L FGF-2可显著降低ALP活性，而10μg/L VEGF则显著增强ALP活性。由此确定采用10%血清浓度培养液，20μg/L FGF-2和10μg/L VEGF作为工作浓度用于后续实验。 3、CCK-8结果显示联合应用FGF-2和VEGF具有协同促增殖效果；划痕损伤迁移愈合实验结果显示，VEGF可促进细胞向创伤部位迁移；细胞黏附实验结果显示，FGF-2可明显促进细胞在聚苯乙烯材料表面的初期黏附与伸展。 4、碱性磷酸酶染色和定量检测、茜素红染色实验、real-time RT-PCR和westernblot结果显示，FGF-2可明显抑制细胞成骨分化，而VEGF可明显促进细胞成骨分化，二者同时施加时FGF-2的作用足以逆转VEGF的正向调节作用，成骨前期施加FGF-2配合中后期VEGF的序列施加可呈现比单独应用VEGF更加明显的促成骨分化效果。 5、扫描电镜观察，经两种因子预处理后，细胞在Bio-Oss骨粉表面黏附、伸展效果优于β-TCP材料表面。 6、植入裸鼠皮下8周，细胞材料复合体HE、masson染色和免疫组织化学染色结果表明VEGF可促进细胞在Bio-Oss骨粉表面形成类骨质样结构，并表达成骨相关蛋白，而FGF-2组细胞几乎无类似结构和成骨相关蛋白表达，成骨前期施加FGF-2配合中后期VEGF的序列施加表现出与体外实验相同的较强促成骨分化效果。结论 FGF-2和VEGF均可呈浓度依赖性促进PDLSCs增殖，且受血清浓度影响，二者联合应用有协同作用；VEGF可增强细胞向创伤部位迁移的能力；FGF-2可促进细胞在聚苯乙烯表面的黏附；FGF-2可明显抑制细胞成骨分化，VEGF可明显促进细胞成骨分化，二者序列施加方式可表现出更加明显的促成骨分化效果。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781.4
【图文】：

相差显微镜,胞核,导液,胎牛血清

导液的配制：配制成含 5×10-4mol/L IBMX、1×10-4mol/L 吲胰岛素、10%胎牛血清和 10-6mol/L 地塞米松的 α-MEM 培养导：待细胞长至对数生长期，弃原液，PBS 漂洗 3 遍，加入组则加入与原培养液相同的新液，每孔加液 1ml。每 3d 换液。染色：弃孔内，PBS 洗 3 遍，4%多聚甲醛固定 30min，PBS 洗溶液（pH=4.5）染色 20min，PBS 洗 3 遍，光镜下观察拍照s 的分离和纯化养的牙周膜组织来源细胞镜下呈簇排列，在组织块周围较密胞浆内可见较大椭圆形胞核，部分胞核有较明显核分裂象（

表面相,流式细胞仪检测,抗原,相关抗原

第四军医大学硕士学位论文 PDLSCs 相关抗原的鉴定流式细胞仪结果显示，克隆细胞表面抗原 CD146、CD105、CD90 表达阳性34、CD14 表达阴性，说明本实验中得到的克隆化细胞属来源于中胚层的间充胞。（图 2）

克隆形成率,甲苯胺蓝染色,克隆细胞,表面相

图 2 流式细胞仪检测 PDLSCs 表面相关抗原Cs 的克隆形成率后，PDLSCs 可形成克隆细胞簇，镜下呈长梭形，克隆状生长紧凑（图 3），计数克隆数得到克隆形成率为 8.5%。

【参考文献】