增强sIgA应答抗牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白DNA疫苗实验研究

发布时间：2020-08-17 08:27

【摘要】： 慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，影响国民健康水平。牙周炎还可能是某些系统性疾病或状况的危险因素。由于牙周炎的治疗目前还比较困难，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。 慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P．gingivalis)是其主要可疑致病菌，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是细菌表面主要毒力因子之一，能够介导P．gingivalis与宿主细胞及P．gingivalis与口腔内其他细菌的粘附，并且可刺激炎性细胞因子的产生。本研究的目的就在于构建能够增强粘膜免疫应答的抗牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白的DNA疫苗，并观察其对P．gingivalis引起的牙槽骨吸收的保护作用。 通过基因重组技术将FimA编码基因插入真核表达载体pIRES，在抗原基因下游插入IL-15编码基因，两段基因之间利用载体自身携带的核糖体内部进入位点IRES连接，使得两个基因的表达互不干扰。构建了真核共表达质粒pIRES-fimA：IL15，同时构建真核表达载体pIRES-fimA。通过酶切、PCR及DNA序列测定鉴定构建的质粒，用Lipofectamine 2000介导转染CHO细胞，用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)验证了重组质粒在哺乳动物细胞能够正确表达FimA和IL-15。 为研究其免疫原性，重组质粒pIRES-fimA：IL 15与pIRES-fimA经滴鼻免疫和肌肉注射免疫BABL／c小鼠，以间接ELISA方法检测血清中IgG和唾液中sIgA抗体水平。发现重组质粒经滴鼻免疫能够激发机体产生特异性的血清IgG和唾液IgA抗体反应，并且pIRES-fimA：IL 15滴鼻免疫产生的唾液IgA抗体滴度显著高于pIRES-fimA滴鼻免疫产生的唾液IgA抗体滴度。pIRES-fimA：IL 15所表达的IL-15可以作为一种辅助性的细胞因子，增强IgA反应。滴鼻免疫是一种有效的粘膜免疫途径，与pIRES-fimA：IL 15肌肉注射免疫相比，两种方法产生的血清IgG反应水平相当，但唾液IgA反应水平显著高于肌肉注射。滴鼻免疫既能产生系统免疫，又能激发粘膜免疫，IL-15对于sIgA反应有正向调节作用。 本研究以重组质粒pIRES-fimA：IL 15作为DNA疫苗，观察其对P．gingivalis引起的实验性牙周炎的保护作用。将疫苗经滴鼻免疫Wistar大鼠，用P．gingivalis接种大鼠口腔，PCR方法检测接种后大鼠口腔中的P．gingivalis菌。实验结束时，取大鼠颌骨去除软组织后测量釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离作为牙槽骨吸收情况，并做组织切片观察组织学改变。比较实验前后各组大鼠体重变化，并取大鼠主要脏器做组织切片观察有无明显病理改变。在P．gingivalis引起的大鼠实验性牙周炎模型上，pIRES-fimA：IL 15经滴鼻免疫牙槽骨吸收量显著小于未免疫组，同时也小于pIRES-fimA免疫组。实验结束时，pIRES-fimA：IL 15和pIRES-fimA免疫组大鼠唾液中未检测到P．gingivalis。在实验前后大鼠体重增加各组之间没有显著差异，大鼠主要脏器也没有明显病理改变。基因疫苗pIRES-fimA：IL 15能够对P．gingivalis引起的实验性牙周炎提供安全有效的保护。 本研究成功的构建了FimA蛋白与IL-15真核共表达质粒，以其作为DNA疫苗经滴鼻免疫能够激发机体产生特异性的系统免疫应答，又能激发粘膜免疫应答，滴鼻免疫可以作为抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗有效的粘膜免疫途径。疫苗所表达的IL-15可以作为辅助因子增强sIga应答，对P．gingivalis引起的实验性牙周炎提供有效的保护，为解决增强sIgA应答来对牙周组织提供保护的难题提供思路。将IL-15基因加入抗牙周炎DNA疫苗中的研究国内外未见报道。滴鼻免疫无痛，易于接受，有利于疫苗的使用和推广。本研究的结果可以为研发用于人类的有效安全防治牙周炎DNA疫苗提供依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R781.42
【图文】：

将目的片段的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳，与DNA相对分子质量Marker比较，得到目的大小片段，刀mA基因片段为 1225bp，IL一巧基因片段为489bP(图2)。连接产物转化大肠杆菌DHS。感受态后的菌液涂布于LA培养皿上，经37℃培养过夜后，未转化的DHS。细菌不能在Amp平皿上生长。所以，能在Anlp平皿上生长的菌落初步认为其含有具有Amp抗性的真核表达质粒。将pIRES一fimA:IL15的Xhol和Mlul双酶切产物(即刀蒯片段)及xbal和Notl双酶切产物(即IL一巧基因片段)琼脂糖凝胶电泳，与相对分子质量Marker比较，得到目的大小片段(图2)。经博亚公司序列测定，真核表达质粒PIRES中插入了读码框架正确的fimA与IL一巧基因片段。2.G418选择培养转染细胞，获得阳性克隆以 G418800mg/L选择培养2周后

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本文编号：2795072