巨颌症致病基因SH3BP2对破骨细胞样细胞分化调控作用的研究

发布时间：2020-08-21 10:42

【摘要】：巨颌症(Cherubism)是一种以领骨骨吸收为特征的遗传病,有大量破骨细胞分布其中。其致病基因SH3BP2编码的蛋白是一种接头蛋白,它在破骨细胞的分化过程中起重要的作用,当其表达在小鼠破骨细胞前体细胞Raw264.7中被阻断后,Raw264.7不能分化为成熟的破骨细胞。巨颌症中的的SH3BP2突变是一类功能获得型突变,它能够上调破骨前体细胞对破骨细胞分化因子(receptor activor of NF-Kb ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factors,M-CSF)的应答。RANKL是诱导生成破骨细胞的必需因子,它与M-CSF联合诱导单核细胞向破骨细胞分化是破骨细胞生成的经典途径。由于体内破骨细胞与间质细胞相混杂、数量少、难于分离,所以研究中通常通过体外诱导单核细胞分化得到破骨细胞,但是因为单核细胞来源有限或者诱导困难,导致体外诱导得到的成熟的破骨细胞数量也很少,这已成为了阻碍研究破骨细胞某些功能的一个瓶颈。目前通过对蛋白SH3BP2的研究,已经发现了一些能与蛋白SH3BP2相互作用并参与调节破骨细胞分化的信号分子(Syk,Src,PLCy),但是仅仅通过这些信号分子,还不足以阐明SH3BP2对破骨细胞分化的调控作用,可能还存在能与其相互作用的其它的蛋白。因此找出这些蛋白,可进一步完善蛋白SH3BP2参与的调节破骨细胞分化的信号通路,为揭示疾病的发生过程,制定合理的基因治疗计划的提供基础。 目的： ①建立一个有效的诱导单核细胞向破骨细胞分化的诱导体系,解决破骨细胞来源问题。 ②构建SH3BP2突变体质粒,并在单核细胞中表达,为研究蛋白SH3BP2调节破骨细胞分化的机制建立一个平台。 ③寻找新的可能参与到破骨细胞分化中且可与SH3BP2相互作用的蛋白,根据这个蛋白的功能结构特点,研究SH3BP2调节破骨细胞分化的作用。 方法： ①RANKL和M-CSF联合诱导破骨细胞前体细胞(单核细胞系THP-1细胞、外周血单核细胞PBMCs和脐带血单核细胞UBMCs)向多核破骨样细胞分化,比较破骨细胞的形态和分化时间,选择易于体外诱导分化的单核细胞。 ②选择四种SH3BP2基因突变体,构建质粒载体。并尝试将质粒转染到单核细胞中。 ③通过生物信息学预测可能与SH3BP2相互作用的蛋白。免疫组织化学染色检测该蛋白在病变中的破骨细胞以及单核细胞向破骨细胞分化过程中的表达。如果有表达,则通过免疫共沉淀实验,检测两种蛋白在破骨细胞中是否有相互作用。 结果： ①THP-1, PBMCs, UBMCs三者比较,在形态上UBMCs生成的破骨细胞样细胞的细胞核数量最多,其次是THP-1,最少是PBMCs。在诱导时间上,THP-1最快分化完成。 ②构建野生型和四种突变型SH3BP2质粒。转染质粒到THP-1细胞中,但是不能表达蛋白。UBMCs在向破骨细胞分化的第14天能够进行质粒转染。 ③FLT-3和SH3BP2同时在巨颌症破骨细胞中和单核细胞向破骨细胞分化的过程中都有表达。 结论： ①THP-1细胞能够在RANKL和M-CSF的联合刺激下分化生成破骨细胞样形态的细胞。 ②构建了四种SH3BP2突变质粒,并在293细胞中检测到蛋白的表达。但是THP-1细胞不能表达质粒编码的SH3BP2蛋白。 ③脐血单核细胞在分化到一定程度以后(lipofectimaine2000是在5天),应用脂质体转染方法能够转染质粒进入细胞中。 ④FLT-3可能参与了SH3BP2调节破骨细胞分化的过程。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R782
【图文】：

检测质粒序列和蛋白的表达通过测序，确定质粒中SH3BPZ基因突变正确，其它位点没有突变。之后将质粒转染入293细胞中，48h后检测到蛋白的表达(图3)。 FIagS日3B尸2 1:Pro， LeU418 2:Pro·A一’ 94183:P!·O卜 H154184:ASP， Gly419图3:将质粒转染入293细胞中，48h后提取细胞全蛋自， westemblot检测蛋白SH3BPZ的表达。A:一抗为Flag抗体，检测到蛋自的表达B:一抗为人sH3BPZ抗体，检测至lJ蛋自的表达。2.3讨论在巨领症中不排除不同的基因突变型对应相同的临床表现型，除了基因突变类型外可能还有其他的体内因素导致临床表现的不同。所以为了观察单纯的基因突变类型对临床表现的影响

应用免疫组织化学染色检测巨领症破骨细胞是否表达蛋白FLT一3和SH3BPZ，以胞浆呈棕色着色为阳性标志，结果显示两种蛋白在巨领症破骨细胞中均呈阳性表达(图7)。，、、，‘-，.、户·

本文编号：2799279