hOPG基因修饰的组织工程化复合物修复自体牙周组织缺损的实验研究

发布时间：2020-09-05 09:50

　　目的：用携带人骨保护素（human osteoprotegerin, hOPG）基因的腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP转染Beagle犬自体牙周韧带细胞（Periodontal ligament cells,PDLCs），并与引导组织再生胶原膜BME-10X复合工程化，将此复合物植入Beagle犬Ⅱ°根分叉病变区，探讨hOPG基因修饰的组织工程化复合物修复自体牙周组织缺损的能力及其促进牙周组织再生的能力。方法：1.体外分离人牙周韧带细胞，采用改良组织块法，分别用MEM-α、DMEM-LG和RPMll640三种培养基培养，观察不同培养基对人牙周韧带细胞体外生物学行为的影响。2.体外分离培养Beagle犬PDLCs，采用改良组织块法培养，免疫细胞化学法鉴定细胞来源。3.体外构建携带hOPG基因的腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP，并将其转染Beagle犬PDLCs，通过流式细胞术、RealTime PCR、ELISA以及Western Blot检测目的基因的转录和表达。4.体外hOPG基因转染Beagle犬PDLCs后，荧光倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，MTT法描绘细胞生长曲线，流式细胞技术检测细胞的周期变化及凋亡情况，Von Kossa染色观察矿化结节生成，Real-time PCR法检测转染细胞中犬ALP、OC、BSP成骨指标的表达变化，ELISA法检测转染后12天内hOPG、cRANKL/cOPG的变化情况。5.转染hOPG基因的Beagle犬PDLCs与胶原膜BME-10X复合，采用荧光倒置相差显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、扫描电镜观察两者复合情况。6.将复合的组织工程化复合物植入16只裸鼠皮下，分别于6周、12周取材拍摄X线片及制作病理切片，HE染色观察基因修饰的工程化复合物在体内再生情况。7.人工构建6只Beagle犬双侧下前磨牙Ⅱ°根分叉病变模型，将转染hOPG基因的Beagle犬PDLCs与胶原膜BME-10X复合，同时设立转染空载及未转染的细胞复合物组、空白膜对照组，分别植入根分叉缺损区，术后6周及12周时拍摄X线片，并于术后12周时处死动物，取受试区牙及牙槽骨，制备颊舌向病理切片，HE染色，通过测量新生牙槽骨面积、新生牙骨质面积观察牙周组织再生情况，结果进行统计学分析。结果：1.α-MEM培养基促进PDLCs增殖，DMEM-LG促进PDLCs分化。2.成功分离培养了Beagle犬PDLCs。3.通过重组腺病毒Ad5-hOPG-EGFP对Beagle犬PDLCs成功进行转染。腺病毒转染72h后转染效率达到80%以上，转染的细胞发出较强的绿色荧光。RealTime PCR、ELISA以及Western Blot检测表明，hOPG在Beagle犬PDLCs中得到了有效表达。4.hOPG基因转染后PDLCs形态略有变化，增殖能力及细胞周期无明显变化，未见明显凋亡，矿化结节增大，cALP、cOC、cBSP表达量增高，转染后12天内hOPG分泌量逐渐增高，cRANKL/cOPG呈下降趋势。5.转染细胞在胶原膜中贴附、伸展，生长良好。在激光共聚焦显微镜下可见发出绿色荧光的细胞附着于胶原膜，分层扫描可见各层胶原膜均有不同数量的PDLCs附着。6.细胞胶原膜复合物植入裸鼠皮下后，转染细胞与BME-10X形成类骨质样结构。7.动物实验结果：hOPG-PDLCs—BME-10X组新生牙骨质长度百分比较空载-PDLCs—BME-10X组、PDLCs—BME-10X组及BME-10X组高（P0.05），而其余三组之间无显著性差异。hOPG-PDLCs—BME-10X组、空载-PDLCs—BME-10X组及PDLCs—BME-10X组的新生牙槽骨面积百分比均较BME-10X组高（P0.05），其中hOPG-PDLCs—BME-10X组又较空载-PDLCs—BME-10X组及PDLCs—BME-10X组高（P0.05），而空载-PDLCs—BME-10X组与PDLCs—BME-10X组之间无显著性差异。结论：1.根据实验要求选择合适培养基。2.hOPG基因可在PDLCs中有效表达。3.hOPG基因转染可以加速PDLCs向成骨细胞表型转化，hOPG基因转染的PDLCs有望成为牙周组织工程理想的种子细胞。4.hOPG基因转染的PDLCs在胶原膜BME-10X上生长良好，hOPG基因转染的PDLCs与胶原膜复合物有望应用于牙周组织工程。5. hOPG基因转染的PDLCs与胶原膜复合物可以促进牙周组织缺损的再生修复，具有良好的临床应用前景。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：

培养基,情况

三组培养基原代细胞的游出情况

旋涡状,培养基,细胞,传代培养

梭形生长（图 1-1）。细胞生长到一定密度后，三组细胞均呈栅栏状或漩涡状生长（图1-2）。三组细胞在细胞游出 7 至 10 天，均可传代培养。但传代后，α-MEM 和DMEM-LG 组细胞较短天数内可以再次传代，RPMI 1640 组则需多培养几日才可再次传代。

曲线,曲线,胞浆内,波形丝蛋白

A：波形丝蛋白染色阳性，胞浆内着棕色（×200）；B：角蛋白染色阴性，胞浆内不×100)。图 1-3 细胞来源鉴定MTT 法检测牙周韧带细胞的增殖曲线：比较 3 组细胞增殖情况，从第 3d 起，α-MEM 组细胞生长就显著快于其，组间有显著性差异（P<0.05）。第 6d 起，DMEM-LG 组和 RPMI 1640显著性差异（P<0.05）（图 1-4）。

【引证文献】