AEG-1在LPS诱导的牙髓炎症中的作用研究

发布时间：2020-09-05 12:52

　　目的:探讨AEG-1在LPS诱发的牙髓炎中的作用及相关机制。方法:为探讨在牙髓炎症中是否有AEG-1的参与,在LPS诱发的SD大鼠牙髓炎模型中,通过免疫组织化学染色检测牙髓炎中AEG-1的表达情况;同时,收集15-25岁临床患者的健康正畸牙或智齿,对其进行牙髓细胞的原代培养,通过RT-qPCR及Western blot检测在不同作用时长和不同浓度LPS刺激后的牙髓细胞中,AEG-1的表达情况。为了检测AEG-1在牙髓炎中的可能作用,通过转染特定的siRNA进入牙髓细胞以敲减细胞中AEG-1的表达水平,使用RT-qPCR(逆转录-实时荧光定量PCR)检测在LPS刺激后的敲减了 AEG-1的牙髓细胞中炎症因子的表达情况。采用Western blot和细胞免疫荧光检测NF-kB信号通路中转录因子p65在LPS刺激的敲减了 AEG-1的牙髓细胞中的入核情况。采用Western blot检测在使用NF-kB和PI3K信号通路阻断剂后,LPS诱发的牙髓细胞中AEG-1的表达情况。结果:AEG-1在LPS诱发的大鼠牙髓炎模型中表达增加。同时,RT-qPCR及Western blot结果显示,AEG-1在LPS刺激的牙髓细胞中表达显著升高,具有浓度依赖性(P0.05)。同时Western blot显示LPS刺激1h后牙髓细胞中AEG-1表达量最高。使用特定siRNA敲减牙髓细胞中的AEG-1表达后,实时荧光定量PCR结果显示牙髓细胞中因LPS刺激导致的炎症因子,包括IL-1β,IL-6及TNF-α的诱发性表达升高情况被部分抑制,差异具有统计学意义(P0.05)。同时,Western blot和细胞免疫荧光结果证实AEG-1的敲减导致LPS诱发的牙髓细胞中NF-kB信号通路转录因子p65的入核量减少。Western blot显示使用NF-kB和PI3K信号通路阻断剂可下调因LPS刺激而在牙髓细胞中表达升高的AEG-1。结论:AEG-1可通过NF-kB信号通路的活化影响LPS刺激下牙髓细胞中炎症因子如IL-1β,IL-6及TNF-α的表达。NF-kB和PI3K信号通路均参与牙髓细胞中因LPS刺激而导致的AEG-1的表达升高。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R781.31
【部分图文】：

信号通路,磷酸化,致癌基因,过增强

图１：邋ＡＥＧ－ｌ／ＭＴＤＨ可通过多种信号通路促进肿瘤的进展。致癌基因Ｈａ＿ｒａｓ可通过激活逡逑ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路增加ＡＥＧ－１／ＭＤＴＨ的表达，随后ＡＥＧ－１引起ＧＳＫ－３Ｐ的磷酸化致其失活，逡逑增强ｃ－Ｍｙｃ的稳定性并结合至ＭＴＤＨ／ＡＥＧ－１的启动子区域。ＭＴＤＨ／ＡＥＧ－１可通过激活ＡＫＴ、逡逑ＮＦ－ｋＢ及Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路来促进肿瘤细胞的增殖、存活和侵袭。激活ＮＦ－ｋＢ是部分通逡逑过ＭＴＤＨ／ＡＥＧ－１与ｐ６５、ＣＢＰ的直接接触获得的。ＡＥＧ－１／ＭＴＤＨ还可通过增强ＭＡＰＫ激酶逡逑ＥＲＫ、ｐ３８来激活Ｗｎｔ／（３－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路，亦可通过磷酸化ＧＳＫ３ｐ稳定卩－ｃａｔｅｎｉｎ或直接促进逡逑ＬＥＦ－１邋的表达来激活Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信号通路。（Ｈｕ邋ｅｔ邋ａｌ．邋２００９）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１：邋ＭＴＤＨ／ＡＥＧ－１邋ｐｒｏｍｏｔｅｓ邋ｔｕｍｏｒ邋ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ．邋Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ邋Ｈａ－Ｒａｓ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｓ邋ＭＴＤＨ／ＡＥＧ－１邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ邋ｐａｔｈｗａｙ，ｗｈｉｃｈ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ邋ａｎｄ邋ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ逡逑ＧＳＫ３Ｐ，ａｎｄ邋ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ邋ｅｎｈａｎｃｅｓ邋ｔｈｅ邋ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ｃ－Ｍｙｃ邋ｔｏ邋ｔｈｅ逡逑ＭＴＤＨ／ＡＥＧ－１邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ．邋ＭＴＤＨ／ＡＥＧ－１邋ｃａｎ邋ａｃｔｉｖａｔｅ邋ＡＫＴ

信号通路,转录因子,相互作用,炎性因子

：图示为可与ＡＥＧ－ｌ／ＭＤＴＨ／ＬＹＲＩＣ相互作用的多种蛋白分子。ＮＬＳ：邋ｔｆ定位信号；逡逑：跨膜区。（Ｅｍｄａｄ，Ｄａｓ２０１３）逡逑ｒｅ邋２：邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＡＥＧ－ｌ／ＭＴＤＨ／ＬＹＲＩＣ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｒｅｇｉｏｎ邋ｔｈａｔ逡逑ａｃｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ｖａｒｉｏｕｓ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ．邋ＮＬＳ，邋ｎｕｃｌｅａｒ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｓｉｇｎａｌ；邋ＴＭＤ，逡逑ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄｏｍａｉｎ．逡逑Ｆ－ｋＢ邋和邋ＣＢＰ逡逑ＡＥＧ－１通过激活ＮＦ－ｋＢ信号通路实现ＡＥＧ－１介导的肿瘤组织的转移、侵袭、逡逑定型肿瘤生长，也可调节炎症反应中炎性因子的表达。ＡＥＧ－１可通过与逡逑Ｂ信号通路中的转录因子ｐ６５相互作用增强ＮＦ－ｋＢ信号通路相关基因的表达逡逑ａｄ，Ｓａｒｋａｒ２００６）。ＮＦ－ｋＢ信号的激活需要转录共激活蛋白，如组蛋白乙酰化逡逑酶（ＨＡＴ）来活化。ＨＡＴ可通过募集转录因子和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ到目的基因的逡逑子区域，来调节染色质的结构。研究显示，ＮＦ－ｋＢ可以与包括ＣＢＰ、ｐ３００及逡逑关因子等几类ＨＡＴ相互作用（Ｃｈｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ．邋２００３）。在此相互作用中，ＨＡＴ使组蛋逡逑

牙髓炎,大鼠

图３：邋ＡＥＧ－１在ＳＤ大鼠牙髓炎中的表达。除对照组外，在大鼠下颌第一磨牙咬逡逑合面打开髓腔，注入ＬＰＳ并用玻璃离子充填，观察在ＬＰＳ作用后牙￥髓细胞中逡逑ＡＥＧ－１的表达情况。（ａ－ｅ）分别为对照组，开髓ＬＰＳ处理一天、三天、五天、七逡逑天组。图中可见，ＬＰＳ造成冠部牙髓坏死，大量炎性细胞浸润，同时，可见ＡＥＧ－１逡逑在对照组中表达量较少，随着ＬＰＳ作用时间的延长，ＡＥＧ－１表达量在牙髓组织逡逑中逐渐增加。（ｆ）对五组中胞核中ＡＥＧ－１阳性的细胞进行了统计分析，显示ＡＥＧ－１逡逑在ＬＰＳ刺激后表达逐渐上升，第五夭达到峰值后逐渐降低。与对照组相比＊尸＜逡逑０．０５，逦＊＊尸＜０．０１，邋＊＊＊尸＜０．００１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋ＡＥＧ－１邋ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄ邋ｉｎ邋ｒａｔ邋ｍｏｄｅｌｓ邋ｏｆ邋ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｄｅｎｔａｌ邋ｐｕｌｐｉｔｉｓ，邋（ａ－ｅ）逡逑Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＡＥＧ－１邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ａｎｄ逡逑ｉｎｆｌａｍｅｄ邋ｐｕｌｐ，邋（ｆ）邋Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＡＥＧ－１－ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ邋ａｒｅａ逡逑ｐｅｒ邋ｈｉｇｈ－ｐｏｗｅｒ邋ｆｉｅｌｄ邋（ｈｐｆ）邋ｏｎ邋ｄａｙｓ邋１，３，邋５，邋ａｎｄ邋７．邋＊尸邋＜邋０．０５，邋＊＊尸邋＜邋０．０１，ａｎｄ邋＊＊＊尸邋＜逡逑０．００１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑

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