雌激素受体在去势大鼠牙周膜干细胞成骨分化中作用的研究

发布时间：2020-09-08 11:47

　　绝经后妇女易出现骨质疏松，已证实这一现象和体内的雌激素缺乏有关，雌激素水平降低可加速体内的骨转换过程，导致骨吸收大于骨形成，从而使体内的骨量减低，引发骨质疏松。如今，骨质疏松已被认为是诱发牙周疾病及牙齿丧失的危险因素之一。通过对绝经后妇女的临床研究表明，在口腔卫生保持不变的情况下，雌激素缺乏的患者牙周病发病率升高。动物实验也已经证实，去除卵巢的雌性大鼠其下颌骨密度降低。然而，雌激素缺乏对牙周组织影响的分子机制仍不明确。牙周膜（periodontal ligament，PDL）是一种特殊的、富含血管的连接牙骨质和牙槽骨的组织，它的存在使得牙齿被固定在牙槽窝里。以往研究表明，在人的牙周膜中含有一些异质性的细胞群体，这些细胞能够在体外分化为成牙本质细胞及成骨细胞。2004年，施松涛教授等人证实，牙周膜韧带中含有牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），此类细胞对牙周组织的再生有着至关重要的作用。雌激素积极地参与骨代谢过程并且有着多功能的调控作用，这在很多研究中已得到证实。它对靶细胞的调控作用主要通过雌激素受体（estrogenreceptor，ER）发挥作用。雌激素受体存在于很多细胞中，比如骨髓基质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblast，PLF）中，并且，在这些细胞的成骨分化过程中，雌激素受体起到了重要的调控作用。但具体的调控机制不明。因此，我们利用去势大鼠营造了一个低雌激素的微环境，提取其牙周膜干细胞，观察其成骨分化的过程，进而研究雌激素受体在此过程中的调控作用以及分子机制。实验设计如下：实验内容：（1）去势大鼠骨质疏松动物模型建立实验分为两组：去势组和假手术组。实验组采用外科手术的方法，切除雌性SD大鼠的双侧卵巢（ovariectomy，OVX），建立骨质疏松的动物模型，假手术组切除卵巢周围少量脂肪组织。3个月后，观察两组大鼠体重、血清雌激素水平以及股骨骨密度（BMD）。（2）去势大鼠牙周膜干细胞的分离、培养及鉴定动物模型构建成功后，拔出两组大鼠的4个第一磨牙，刮下根中部表面上的牙周韧带组织，采用酶消化+组织块法培养原代细胞，利用免疫磁珠技术对此种细胞进行筛选、纯化，从而获得STRO-1高表达的牙周膜干细胞。利用倒置显微镜观察、增殖速率的测定比较两组大鼠生物学特性的区别。而后，通过流式细胞仪检测及成骨诱导鉴定获得的牙周膜干细胞。（3）雌激素受体对去势大鼠牙周膜干细胞成骨分化能力的影响利用实时定量PCR的方法，观察大鼠牙周膜干细胞成骨分化过程中雌激素受体及成骨指标的变化。而后，在雌激素刺激及慢病毒干涉载体下调雌激素受体后，检测成骨指标的变化。（4）雌激素受体对去势大鼠牙周膜干细胞Notch信号通路的影响文献表明，Notch信号通路与细胞的成骨分化关系密切，因此，本实验拟以Notch信号通路为切入点，初步探讨雌激素受体影响牙周膜干细胞成骨能力的分子机制。首先，观察了牙周膜干细胞成骨分化过程中Notch受体（Notch1）及配体（Jagged1）基因和蛋白的表达，而后，检测了雌激素刺激后及下调雌激素受体表达后Notch信号通路的变化。结果：（1）术后3个月，两组间大鼠体重、雌激素水平及股骨骨密度均具有统计学差异。去势组大鼠体重增加，雌激素水平和股骨骨密度降低。（2）通过流式细胞仪分析，与未筛选前的牙周膜细胞相比，牙周膜干细胞呈现STRO-1及CD146的高表达，这表明我们获得了纯化较好的牙周膜干细胞。MTT结果显示，去势后，大鼠牙周膜干细胞增殖速率变快。（3）牙周膜干细胞成骨诱导过程中，去势组牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性、雌激素受体及成骨基因的表达低于假手术组，茜素红染色结果证实了以上结论。最后，在17β-雌二醇的刺激下，牙周膜干细胞的成骨分化能力增强；下调ERα和ERβ表达后，牙周膜干细胞的成骨分化能力减弱。（4）Real-time PCR及Western blot的结果表明，去势大鼠牙周膜干细胞的成骨分化过程中，Notch信号通路中受体Notch1、配体Jagged1在基因及蛋白的水平上均有表达。给予雌激素刺激后，Notch受体和配体的表达都有不同程度升高；下调ERα和ERβ表达后，Notch受体和配体表达升高的程度降低。结论：（1）去势大鼠牙周膜干细胞的增殖能力增强但成骨能力减弱，雌激素受体在雌激素介导的牙周膜干细胞成骨分化过程起到了重要的调控作用。（2）雌激素受体对Notch信号通路中受体Notch1、配体Jagged1具有调控作用。提示，雌激素受体可能通过对Notch信号通路的调控来影响牙周膜干细胞的成骨能力，但具体的分子机制有待进一步阐明。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R781.4

【参考文献】