小鼠EPM细胞Sp8基因沉默对Shh、Wnt信号表达的影响研究

发布时间：2020-09-09 21:28

　　 目的:沉默体外培养的小鼠腭胚突间充质(Embryonic Palate Mesenchymal,EPM)细胞的Sp8基因,检测Shh、Wnt信号通路相关信号因子的表达,探讨Sp8是否参与调控Shh、Wnt通路相关信号因子的表达及传递。方法:1.采用安死术处死胚胎13.5天的C57BL/6J孕鼠,无菌条件下取出胚胎,分离获取腭胚突间充质组织,酶消化法培养细胞,免疫组化染色法进行细胞生物学鉴定。2.梯度实验测定最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)值,利用慢病毒介导的RNAi技术沉默第3代EPM细胞的Sp8基因,倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR选择Sp8基因沉默最佳慢病毒靶点。3.将EPM细胞分为三组:LV-Sp8-RNAi实验组、阴性对照病毒组、空白对照组,用Western Blot技术分别检测PTCH1(Patched1)、GLI3、WNT3A、β-catenin蛋白的表达水平,并进行统计学分析。结果:1.酶消化法获取的EPM细胞经传代培养至第3代时细胞纯度较高,细胞呈梭形、多角形贴壁生长;免疫组化染色法鉴定所培养的细胞为EPM细胞。EPM细胞抗波形蛋白(Anti-Vimentin antibody)阳性;抗角蛋白(Anti-pan Cytokeratin antibody)阴性。2.倒置荧光显微镜观察转染后72h的EPM细胞,在MOI=40时荧光表达量约80%左右;RT-PCR选择Sp8基因沉默最佳慢病毒靶点为LV-Sp8-RNAi2号靶点,该靶点对应组细胞的Sp8m RNA相对表达量最低(P0.01),差异具有统计学意义。3.Western Blot结果显示与空白对照组、阴性对照组相比,LV-Sp8-RNAi实验组的WNT3A、β-Catenin表达水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01),GLI3表达水平略有降低,差异有统计学意义(P0.05),PTCH1表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P0.01)。结论:1.C57BL/6J胎鼠EPM细胞中Sp8基因沉默后可导致WNT3A、β-catenin相对表达量显著降低,推断Sp8基因参与调控小鼠EPM细胞中的Wnt信号传导通路。2.Sp8基因沉默后引起PTCH1相对表达量明显升高、GLI3相对表达量降低,推断Sp8基因参与调控小鼠EPM细胞中的Shh信号传导通路。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R782.2
【部分图文】：

图 1 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎Fig. 1 The C57BL6J mouse embryo of ED13.5注：图 1A 为 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎，图 1B 中黑色箭头所指为腭板，P 代表腭板e:Figure.1Ais an Ed 13.5 C57BL6J mouse embryo, and the black arrow in Fig. 1B indicates the palate, P:Palate2 腭胚突间充质细胞的培养置相差显微镜观察细胞生长情况。BA

图 1 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎Fig. 1 The C57BL6J mouse embryo of ED13.5 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎，图 1B 中黑色箭头所指为腭板， 13.5 C57BL6J mouse embryo, and the black arrow in Fig. 1B indi质细胞的培养观察细胞生长情况。A1.5mm

遵义医科大学硕士学位论文 程忠委2.1.3 腭胚突间充质细胞鉴定显微镜下观察 EPM 细胞免疫组化染色，根据染色鉴定结果可知该细胞具有间充质细胞生物学特性，通过统计学分析得出该细胞阳性百分比为(96.35±2.15)%；结合细胞形态学观察和染色结果可认为该细胞为小鼠 EPM 细胞。

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