Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨过程中调控作用的探索性研究

发布时间：2020-09-11 19:45

　　正畸临床中对牙齿施加合适的正畸力后，围绕牙根的牙槽骨和牙周膜将发生适应性改变，进而牙齿将发生位置的移动。牙齿移动过程中张力侧主要是成骨过程而压力侧主要是骨吸收过程，两侧平衡协调共同作用而使牙齿发生预期的移动。在张力侧以成骨活动为主的骨改建过程中，牙周膜组织发挥了重要的介导作用。通过体内外研究，现在已经证实正畸力的刺激通过胞外基质传导至胞浆内，引起一系列细胞因子的合成，包括细胞因子、生长因子、酶类以及结构分子类的表达和合成，并参与了细胞的分化、增殖以及功能的变化，如前列腺素类(PGs)、环单磷酸腺苷(cAMP)、肌醇磷酸类、钙离子通道、分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等信号参与了人牙周膜细胞的成骨分化过程。而细胞在机械应力作用下成骨过程并非只是启动某一个的信号通路，而是多种通路在时空顺序上的协同作用。但这个成骨过程的具体机制目前并不明了。早期研究表明：Hedgehog(Hh)信号通路对多种动物以及人体组织和器官的形态发生有着至关重要的调控作用，对成体组织的功能稳定和干细胞的增生分化也有促进作用。但在脊椎动物和果蝇间，Hh信号通路总体的作用机制和大多数的关键信号通路因子是保守的。近期研究表明：在脊椎动物中，Hh蛋白有三种同源体，Sonichedgehog(Shh)，Indian hedgehog(Ihh)，Desert hedgehog(Dhh)，而其中的Shh和Ihh与成骨分化关系密切。有学者发现Hh信号通路在间充质细胞的成骨化过程中发挥了积极的调控作用。本课题组在前期工作中，不仅成功分离获取了人牙周膜干细胞(human periodontalligament stem cells，PDLSC)，还经实验证实，PDLSC在动态张应力作用下向成骨细胞分化，但调控机制不明。鉴于Shh和Ihh与多样细胞的成骨作用有着密切关系，我们推测Hh信号通路可能在PDLSC应力成骨细胞分化过程中发挥了作用，并据此设计了本实验，首先初步探明PDLSC在应力成骨的同时，Hh信号通路被激活；再通过激动剂purmorphamine和抑制剂cyclopamine调控Hh信号通路的活性，借以佐证Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调控作用，以期从分子水平探讨矫治性牙位移动的发生机制，为深入研究矫治性牙位移动机理建立一个全新的实验研究模型。目的：利用体外分离培养的PDLSC，并经细胞应力实验证实Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调控作用，探索PDLSC的应力成骨调控机制。方法 1人牙周膜干细胞的分离、培养及鉴定在西南医院口腔科取12~24岁间因正畸需要而拔除的健康前磨牙或阻生的第三磨牙，牙周牙体及全身状况均健康，并经知情同意。刮取牙根中三分之一的牙周膜组织，经Ⅰ型胶原酶消化40分钟，离心收集后种于6孔板原代培养。获得牙周膜细胞后，通过改良法克隆化培养得到PDLSC，经测定细胞克隆形成率、免疫荧光检测角蛋白及波形蛋白、流式细胞术分析细胞表面标志物STRO-1和CD146以及成骨、成脂诱导分化实验进行干细胞特性的鉴定，为PDLSC应力成骨实验和Hh信号通路效应蛋白的检测作准备。 2动态张应力下人牙周膜干细胞成骨过程中Hh通路的检测为了解PDLSC应力成骨过程中，Hh信号通路的活性状况。本研究取第4~6代PDLSC种于BioFlex专用加载六孔培养板(孔底为硅胶膜)内，在矿化诱导环境下运用国际标准化水准的FX-4000T加载系统进行动态张应力加载，方式为最大形变12%、最小形变为0的正弦波，频率为0.1Hz(5s拉抻5s放松)张应力，作用时间24h，对照组的BioFlex板静置培养不加力；以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)监测动态张应力作用下，PDLSC成骨标志物Runx2、ALP的mRNA的合成与表达的改变；以及Hh信号通路关键效应蛋白GLI1、PTCH1、SMO的mRNA的合成与表达的改变。 3purmorphamine对人牙周膜干细胞应力成骨的影响为证实Hh信号通路对PDLSC应力成骨的正向调控作用，本实验取第4~6代PDLSC种于BioFlex专用加载六孔培养板，在矿化诱导环境下加入不同浓度的purmorphamine(1μM，2μM，4μM)，加载最大形变为12%、最小形变为0的正弦波，频率为0.1Hz(5s拉抻5s放松)张应力，对照组在BioFlex板孔内只加入purmorphamine溶剂DMSO(10-2M)，作用24h，以real-time PCR检测张应力作用前后，PDLSC成骨相关标志物Runx2、ALP合成与表达的变化；Hh信号通路的相关标志物GLI1、PTCH1、SMO在mRNA水平表达的变化情况。 4cyclopamine对人牙周膜干细胞应力成骨的影响为证实Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调控作用，本实验取第4~6代PDLSC种于BioFlex专用加载六孔培养板内，并在矿化诱导环境中加入cyclopamine(5μM)，加载最大形变为12%、最小形变为0的正弦波，频率为0.1Hz(5s拉抻5s放松)张应力，对照组在BioFlex板孔内只加入cyclopamine溶剂DMSO(10-2M)，作用24h，以real-time PCR检测张应力作用前后，PDLSC成骨相关标志物Runx2、ALP和Hh信号通路的相关标志物GLI1、PTCH1、SMO在mRNA水平表达的变化情况。结果 1改良法克隆化培养可成功得到PDLSC，其外形为梭形、多角形或不规则形，体积比牙周膜细胞稍小，呈漩涡状、放射状排列；细胞具有较高的克隆形成率(13.87%)；PDLSC经免疫荧光检测波形蛋白阳性，角蛋白表达阴性；流式细胞术结果显示PDLSC高表达间充质干细胞表面标志物STRO-1(89.9%)和CD146(91.3%)；成骨诱导3周后茜素红染色阳性，有矿化结节形成；成脂诱导3周后，可见脂滴形成，油红O染色阳性，说明所得细胞具有多向分化能力： 2PDLSC经FX-4000T加载24h后，其成骨性指标Runx2、ALP的表达增强（P0.05）；同时Hh信号通路的关键效应蛋白GLI1、PTCH1、SMO的合成与表达也增强（P0.05），说明在PDLSC应力成骨的同时，Hh信号通路被激活。 3为证实Hh信号通路对PDLSC应力成骨的正向调控作用，本实验以不同浓度的purmorphamine上调Hh信号通路活性，结果发现：不同浓度purmorphamine刺激下，GLI1、PTCH1、SMO的合成表达增强（P0.05），并呈现明显的剂量效应关系；同时，成骨性指标Runx2、ALP的合成表达增强（P0.05），也呈现明显的剂量效应关系，首度证实了Hh信号通路对PDLSC应力成骨的正向调控作用。 4为进一步证实Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调控作用，本研究采用Hh信号通路抑制剂cyclopamine下调Hh信号通路活性，反向证明Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调控作用。结果发现：加入定量cyclopamine后，PDLSC在应力24h后，其GLI1、PTCH1、SMO的合成表达仅略有增加，同时成骨性指标Runx2、ALP也略有增加，但低于对照组水平（P0.05）。结论 1尽管获取足量的实验用种子细胞仍然是我们开展PDLSC细胞应力实验的一个瓶颈，但是经我们改良的克隆化培养法是一种有效的获取PDLSC的途径和方法。 2本课题组首度经实验证实：①在PDLSC应力成骨过程中Hh信号通路被同步激活；②用兴奋剂purmorphamine上调Hh信号通路活性后，PDLSC的应力成骨作用增强，并且这种增强作用在一定范围内呈现剂量依赖性；③在反向下调Hh信号通路活性实验中，应用抑制剂cyclopamine后，PDLSC的应力成骨作用增加变缓。所有实验结果均证明：Hh信号通路参与了PDLSC应力成骨的调控过程。本课题组在前期研究证实，动态张应力促PDLSC向成骨细胞转化，为矫治性牙槽骨应力改建的成骨细胞寻求到了可靠的来源，为深入探讨牙颌畸形的矫治机理打下了坚实的基础。本课题是在前期研究基础上的深入，目的在于探寻PDLSC的应力成骨调控机制，而随着PDLSC应力成骨调控机制研究的深入，必将为正畸临床的技术体系革新和治疗流程的优化提供理论依据，而且还能从增强成骨性修复的角度，为增进与提高临床牙周病的治疗提供理论依据。另外，本实验所建立的细胞应力实验研究模式，已经证明了Hh信号通路对PDLSC应力成骨具有直接的调控作用。诚然，PDLSC应力成骨的调控机制可能涉及多条信号通路，且不同信号通路之间还可能有多样的网络状关系，因此目前尚不能评价Hh信号通路对PDLSC应力成骨的调节强度。但我们已经建立的细胞应力实验研究模式，对于从分子水平探讨矫治性牙位移动的调控机制，为深入研究牙颌畸形矫治机理打下了坚实的基础。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R783.5
【部分图文】：

牙周膜,牙齿,标本,孔板

图 1-1 已刮取根中份牙周膜的牙齿标本图 1-2 hPDLC 原代×40图 1-3 96 孔板内单细胞×40 图 1-4 96 孔板内克隆形成×40

孔板,克隆形成,牙周膜,牙齿

图 1-1 已刮取根中份牙周膜的牙齿标本图 1-2 hPDLC 原代×40图 1-3 96 孔板内单细胞×40 图 1-4 96 孔板内克隆形成×40

孔板,硕士学位论文,牙周膜,牙齿

6孔板内单细胞×40

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