MB-PDT与HMME-PDT对变形链球菌菌斑生物膜作用的对比研究

发布时间：2020-09-16 12:16

　　目的:本实验研究对比亚甲基蓝(methylene blue,MB)与血卟啉单甲醚(Hematoporyrin monomethyl Ether,HMME)两种光敏剂及其介导的光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)在两种能量密度下对体外培养的变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)生物膜的灭菌效果。检测两种光敏剂及各自介导的PDT疗法对于变形链球菌生物膜产酸及代谢能力的影响。使用激光共聚焦显微镜观察处理后变形链球菌生物膜图像,并通过软件处理图像生成的结果判断生物膜中细菌活性。通过对比两种光敏剂介导的光动力疗法疗效,探讨不同光敏剂对细菌的杀菌原理,以期为临床光动力疗法光敏剂及能量选择,研制适宜口腔临床应用的光敏剂提供理论支持。方法:1.平板菌落计数:在羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)圆盘上培养变形链球菌生物膜建立模型,并将其分为8组。其中1、4组为单纯光敏剂组,2、3组为MB-PDT组,5、6组为HMME-PDT组,其中2、5组使用15.2J/cm~2激光照射,3、6组使用30.4J/cm~2激光照射;7组为生理盐水对照组,8组为0.2%氯己定组。PDT组中每组使用光敏剂浓度均为50μg/ml,光敏剂孵育时间5分钟。各组处理完成后逐级稀释,进行平板菌落计数确定各组活菌数量。2.产酸能力测定:将各组处理后样本继续培养3小时,使用乳酸检测试剂盒并通过酶分光光度法测定L-乳酸的浓度。3.激光共聚焦图像观察:将各组处理后样本进行活死菌染色,各组挑选3个样本置于激光共聚焦显微镜观察,进行图像信息采集及处理,计算活菌数量(绿色信号强度)与死菌数量(红色信号强度)的比例。结果:1.平板菌落计数显示:与生理盐水对照组相比,所有PDT治疗组(第2、3、5、6组)均显示出菌落数量减少,差异有统计学意义(p0.05)。在PDT组中,30.4J/cm~2MB-PDT组的灭菌效果优于15.2J/cm~2MB-PDT组,差异有统计学意义(p0.05);30.4J/cm~2HMME-PDT组的灭菌效果优于15.2J/cm~2HMME-PDT组,差异有统计学意义(p0.05)。不同光敏剂间比较,15.2J/cm~2MB-PDT组较15.2J/cm~2HMME-PDT组灭菌效果更好,差异有统计学意义(p0.05);30.4J/cm~2MB-PDT组较30.4J/cm~2HMME-PDT组灭菌效果更好,差异有统计学意义(p0.05)。与阳性对照组相比,30.4J/cm~2MB-PDT组及30.4J/cm~2HMME-PDT组优于0.2%氯己定组,差异有统计学意义(p0.05)。单独MB组与单独HMME组与生理盐水组对比差异无统计学意义(p0.05)。2.L-乳酸浓度检测结果:与生理盐水对照组相比,所有PDT治疗组(第2、3、5、6组)均显示出乳酸浓度降低,差异有统计学意义(p0.05)。PDT组中,30.4J/cm~2PDT组与15.2J/cm~2PDT组差异没有统计学意义(p0.05);15.2J/cm~2MB-PDT组与15.2J/cm~2HMME-PDT组差异不具有显著性(p0.05);30.4J/cm~2MB-PDT组与30.4J/cm~2HMME-PDT组差异没有统计学意义(p0.05)。15.2J/cm~2MB-PDT组、30.4J/cm~2MB-PDT组、15.2J/cm~2HMME-PDT组、30.4J/cm~2HMME-PDT组的乳酸浓度与0.2%氯己定组对比,差异均没有统计学意义(p0.05)。3.激光共聚焦图像处理结果:激光共聚焦图像中,1、4、7组图像中可见大面积绿色信号,红色信号较少,说明样本区域存在大量活菌。2、5、8组图像中可见大部分区域呈红、黄色,绿色信号分布较少,说明样本区域死菌数量较多。3、6组图像中可见大量红-黄色信号,绿色信号几乎不可见,说明样本区域内死菌数量极多,活菌数量少。激光共聚焦图像分析结果显示,与生理盐水对照组相比,所有PDT治疗组(第2、3、5、6组)均显示出活菌比例降低,差异有统计学意义(p0.05)。在PDT组中,30.4J/cm~2MB-PDT组的活菌比例低于15.2J/cm~2MB-PDT组,差异有统计学意义(p0.05);30.4J/cm~2HMME-PDT组的活菌比例低于15.2J/cm~2HMME-PDT组,差异有统计学意义(p0.05)。不同光敏剂间比较,15.2J/cm~2能量密度的MB-PDT组与HMME-PDT组间差异没有统计学意义(p0.05);30.4J/cm~2能量密度的MB-PDT组HMME-PDT组PDT组间差异没有统计学意义(p0.05)。与阳性对照组相比,15.2J/cm~2MB-PDT组、15.2J/cm~2HMME-PDT与0.2%氯己定组活菌数量比例之间相比差异没有统计学意义(p0.05);30.4J/cm~2MB-PDT组30.4J/cm~2HMME-PDT组活菌比例低于0.2%氯己定组,差异有统计学意义(p0.05)。结论:在本研究条件下可得出结论,PDT疗法对于菌斑生物膜中的变形链球菌有灭菌作用,其中高能量密度PDT治疗灭菌效果优于低能量密度PDT治疗,MB-PDT的灭菌效果优于HMME-PDT。PDT治疗会使变形链球菌菌斑生物膜产酸能力降低。PDT治疗会使菌斑生物膜中活菌比例降低。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R781.1
【部分图文】：

图像,绿色,样本,信号

13图 3-（1-4） 1-4 组激光共聚焦图像注：图为 1-4 组观察区域图像，图中绿色信号代表活细菌；红色信号表示细胞受损死亡的细菌；黄色图像是红色及绿色信号叠加的结果。1 中可见大面积绿色信号，红色信号较少，说明样本区域存在大量活菌。2 中红色信号比例增加，图像大部分区域呈红、黄色，说明样本区域内死菌数增加。3 中绿色信号及红色信号均较弱，图像较暗淡，图像绝大多数区域呈红黄色。4 中可见绿色信号较强，红色信号仅隐约可见，说明样本区域内死菌数极多，活菌数量少。

图像,绿色,样本,红色

14图 3-（5-8） 5-8 组激光共聚焦图像注：图为 5-8 组观察区域图像，图中绿色信号代表活细菌；红色信号表示受损/死亡的细菌；黄色图像是红色及绿色信号叠加的结果。5 中可见较多红色信号，图像大部分区域呈红-黄色，说明样本区域内死菌数量较多。6 中绿色、红色信号均较少，图像暗淡且绝大多数区域呈红色，说明样本区域内死菌数量极多，活菌数量少。7 中绿色信号及红色信号均较明显，说明样本中活、死菌数量相当。8 中可见绿色信号较强，红色信号较弱，说明样本区域存在大量活菌。

红信号,强度比,统计学意义

图 4 各组绿、红信号强度比表 3 及图 4 中显示各组绿红信号强度比例结果：与生理盐水对照组相比，所有 PDT 治疗组（第 2、3、5、6 组）均显示比例降低（p<0.05）。在 PDT 组中，30.4J/cm2MB-PDT 组的活菌比例2J/cm2MB-PDT 组（p<0.05）； 30.4J/cm2HMME-PDT 组的活菌比例低2J/cm2HMME-PDT 组（p<0.05）。不同光敏剂间比较，15.2J/cm2能量密度的 MB-PDT 组与 HMME-PDT 没有统计学意义（p>0.05）；30.4J/cm2能量密度的 MB-PDT 组 HMME-PDT 组间差异没有统计学意义（p>0.05）。与阳性对照组相比，15.2J/cm2MB-PDT 组、15.2J/cm2HMME-PDT 与 0.2组活菌数量比例之间相比差异没有统计学意义（p>0.05）；30.4J/cm2MB-30.4J/cm2HMME-PDT 组活菌比例低于 0.2%氯己定组（p<0.05）。

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