转录因子FOXO3a在口腔鳞癌中的作用及在肿瘤靶向治疗中应用的初步研究

发布时间：2020-09-16 20:07

　　 目的： 口腔鳞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。口腔鳞癌的治疗,目前主要以外科手术为主,协同放化疗或生物治疗等的综合治疗,虽已取得了一定效果,但对于中晚期口腔鳞癌患者,疗效仍不理想,总体生存率并无显著提高。本文将研究转录因子FOXO3a在口腔鳞癌中的表达及其功能活性调控与PI3K/AKT信号转导通路的相互关系,同时探讨FOXO3a功能再活化对口腔鳞癌细胞在体内外的抗癌作用。通过本研究,拟为靶向治疗筛选口腔鳞癌癌变过程中的关键基因,为今后口腔鳞癌靶向治疗研究打下一定的基础,以期为口腔鳞癌提供一种新的治疗策略以补充甚至替代现有的治疗手段。 方法： 1、应用Real-time PCR与免疫组织化学的方法分别在mRNA与蛋白水平检测63例口腔鳞癌组织标本和癌旁正常组织中转录因子FOXO3a基因的表达,并通过统计处理,分析其基因表达与烟酒暴露、肿瘤部位、大小、TNM临床分期、病理分级及淋巴结转移等临床病理的相关性；初步分析FOXO3a基因表达与PI3K/AKT信号转导通路中的癌激酶AKT的活性蛋白p-AKT表达的相关性。 2、单纯或联合应用IGF-1与PI3K/AKT信号转导通路抑制剂LY294002处理口腔鳞癌细胞,通过蛋白免疫印迹法检测AKT的活性蛋白p-AKT表达水平,反映PI3K/AKT信号转导通路的激活或抑制状态；应用蛋白免疫印迹法检测FOXO3a及p-FOXO3a蛋白在细胞总蛋白及胞浆胞核蛋白中的表达变化；应用Real-timePCR与蛋白免疫印迹法分别在mRNA与蛋白水平检测在致癌过程中与FOX03a功能活性状态相关的p27、Bim、CDK4、CDK6及cyclin D1等基因的表达变化；经转染FOX03a转录特异性DNA结合序列的荧光素酶报告基因质粒及野生型FOX03a表达质粒后,应用双荧光素酶报告基因法检测FPX03a与其转录启动子特异性DNA序列的结合能力,从而探讨PI3K/AKT信号转导通路与FOX03a功能活性的调控作用。 3、应用小RNA干扰技术和基因克隆DNA重组技术(野生型FOXO3a/FOXO3a-WT与构造活化型FOX03a即AKT依赖的磷酸化位点突变型/FOXO3a-3A)研究FOXOa基因表达沉默或过表达对口腔鳞癌细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期分布等体外生物学行为及接种裸鼠皮下对体内移植瘤成瘤能力的影响。应用Real-time PCR与蛋白免疫印迹法分别在mRNA与蛋白水平检测在致癌过程中与FOXO3a功能活性状态相关的p27、Bim、CDK4、CDK6及cyclin D1等基因表达,及FOXO家族中FOXO1与FOXO4的表达情况,分析上述基因表达与FOXO3a功能活性的相关性,探讨FOXO3a对口腔鳞癌细胞在体内外抑癌作用发挥的可能效应靶基因。 4、探讨Cisplatin与Rapamycin分别单纯或联合处理口腔鳞癌细胞后FOXO3a基因的表达、蛋白在细胞内定位及转录活性情况等,并检测其对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期分布等体外生物学行为的影响,同时对FOXO3a可能的效应靶基因p27、Bim、CDK4、CDK6及cyclin D1的表达进行检测。应用小RNA干扰沉默FOXO3a表达,体外筛选并培养稳定沉默FOXO3a表达的口腔鳞癌细胞,与其父代口腔鳞癌细胞分别接种裸鼠皮下,采用Cisplatin与Rapamycin分别单独或联合治疗移植瘤,在体内观察药物对肿瘤细胞生长的作用,并探讨FOXO3a功能再活化在其中所起的作用。 结果： 1、与全身其它恶性肿瘤类似,口腔鳞癌临床组织标本中同样发现FOXO3a蛋白表达水平的降低,但其mRNA表达水平无明显变化。FOX03a蛋白表达的降低与患者的吸烟、饮酒、肿瘤大小、TNM临床分期、淋巴结转移等临床病理指标间未见明显相关性,但FOXO3a蛋白表达的降低与肿瘤的病理分级及癌激酶AKT的活性蛋白p-AKT表达水平具有显著相关性。 2、通过IGF-1处理口腔鳞癌细胞后,我们发现癌激酶AKT的活性蛋白p-AKT表达明显上调,当采用PI3K/AKT信号转导通路抑制剂LY294002处理后,p-AKT蛋白表达则显著降低,即证实通过上述两种处理能够调控PI3K/AKT信号转导通路的活性。通过抑制或激活PI3K/AKT信号转导通路的活性,我们发现FOX03a转录功能失活与癌激酶AKT的功能异常活化相关,AKT具有对胞核内FOXO3a蛋白磷酸化修饰作用,诱导FOXO3a出核转运,胞浆内磷酸化的FOXO3a可能通过泛素-蛋白酶体途径降解,最终导致口腔鳞癌细胞FOX03a蛋白表达降低,同时还发现口腔鳞癌细胞中AKT功能活性对FOXO3a下游与细胞周期停滞和凋亡诱导密切相关的重要靶基因Bim与p27表达的调控,此外cyclin D1、CDK4与CDK6基因表达与FOX03a功能活性可能相关。 3、口腔鳞癌细胞中过表达FOX03a-WT,可引起PI3K/AKT信号转导通路的反馈性抑制,过表达AKT依赖的FOX03a三磷酸化位点(Thr32,Ser253及Ser315)突变的FOXO3a-3A可抵抗AKT的反馈性抑制。转录因子FOXO3a参与调控口腔鳞癌中细胞周期失控及细胞凋亡机制异常相关基因的表达,FOXO3a功能再活化后,可上调p27与Bim的mRNA与蛋白水平、下调cyclin D1的mRNA与蛋白水平、下调CDK4与CDK6蛋白水平。口腔鳞癌细胞中FOXO3a功能再活化可显著上调FOXO家族的其他两大重要成员FOXO1与FOXO4的表达。转录因子FOXO3a功能活性的获得或丢失能影响口腔鳞癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡和裸鼠体内移植瘤成瘤能力。 4、Cisplatin通过抑制癌激酶AKT活性蛋白p-AKT对FOXO3a的磷酸化出核转运,可上调口腔鳞癌细胞FOXO3a表达,同时FOXO3a功能再活化介导了Cisplatin对Tca8113细胞的体内外部分抑癌作用。Rapamycin能提高FOXO3a蛋白稳定性,但FOXO3a蛋白表达水平却无明显上调,同时我们还发现Rapamycin抑制了泛素连接酶Skp2蛋白表达,促使了癌激酶AKT反馈性活性上调。Rapamycin与Cisplatin联用处理Tca8113细胞,在上调FOXO3a蛋白稳定性的同时,又抑制了癌激酶AKT的反馈性激活,从而显著上调FOX03a表达,协同再活化FOX03a功能；此外,FOXO3a功能再活化介导了由Rapamycin与Cisplatin联用对Tca8113细胞的体内外协同抑癌作用,而两者联用对FOXO3a基因表达沉默的Tca8113细胞裸鼠移植瘤模型体内成瘤无协同抑制作用。 结论： 1、口腔鳞癌中FOX03a蛋白表达明显降低,并且与肿瘤的病理分级显著相关,但其mRNA表达无明显变化,进一步验证了FOX03a基因在包括口腔鳞癌在内的恶性肿瘤发生发展中不存在突变,其功能失活与翻译后蛋白水平的复杂调控有关。 2、癌激酶AKT与FOX03a功能活性调控相关,AKT通过磷酸化胞核内FOX03a蛋白,诱导其出核转运并降解,从而使FOX03a功能失活,证实了FOX03a功能活性与细胞周期停滞和凋亡诱导中的重要靶基因Bim、p27、cyclin D1、CDK4与CDK6等表达相关。 3、过表达FOX03a基因可引起AKT反馈性活化,构造性活化的FOX03a能抵抗该反馈性回路调控,从而可在体内外发挥最强大的抑癌作用。此外过表达FOX03a亦能诱导FOXO1与FOXO4表达,因此可能产生一系列级联放大的抑癌作用,进一步验证了FOXO3a可考虑作为肿瘤基因治疗靶点的候选基因。 4、Rapamycin在提高FOXO3a蛋白稳定性的同时激活了AKT的反馈性活化,Cisplatin可抑制AKT对FOXO3a的负性调控,两者联用在口腔鳞癌细胞FOXO3a功能再活化方面具有显著的协同效应,处理肿瘤细胞后FOXO3a功能再活化介导了Rapamycin与Cisplatin在体内外强大的抑癌作用。基于抑制其负性反馈机制的靶向FOXO3a功能再活化将为肿瘤靶向治疗提供一个合理高效的策略。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R739.8

【共引文献】

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本文编号：2820318