牙龈干细胞和牙周膜干细胞条件培养液对大鼠牙周缺损再生影响的比较研究
发布时间：2020-09-16 20:38
研究背景与目的:牙周病治疗的最终目标是使因炎症破坏的牙周组织得到再生和重建,基于干细胞、支架材料、生长因子的组织工程技术为牙周组织再生提供了有效的思路和方法。虽然间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗在再生医学领域取得了一定的效果,但仍存在所需细胞量大、生存率低、致瘤和致畸等安全性问题,因此亟需新的方法以促进组织再生。越来越多的研究表明,干细胞的旁分泌功能,即干细胞移植后分泌的生长因子、细胞因子是干细胞促进组织再生的主要机制。相比于干细胞移植,间充质干细胞条件培养液(Conditioned medium from MSCs,MSCs-CM)使用更加方便安全,具有更好的临床转化前景。牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是来源于牙周膜的一种成体干细胞,被认为是牙周再生治疗中较理想的种子细胞。研究表明应用PDLSCs移植或者PDLSCs-CM均获得了一定程度的牙周组织再生。然而,体外获取PDLSCs需要有多个拔除牙齿的牙周膜,培养成功率较低,分离获得周期较长。因此,PDLSCs在牙周再生治疗中的广泛应用受到了很大限制。牙龈干细胞(Gingiva-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)是从牙龈中分离出来的间充质干细胞,具有自我更新、多向分化潜能等间充质干细胞的特性,用于牙周组织再生,亦取得了一定效果。相比于牙周膜干细胞,GMSCs取材方便,易于培养,免疫调节功能更加优越,因此GMSCs在牙周再生方面有更好的临床应用前景。目前还未见有牙龈间充质干细胞条件培养液用于牙周组织再生的研究。因此,本研究的目的是利用大鼠下颌第一磨牙牙周骨缺损模型,研究GMSCs-CM对牙周缺损再生的效果,并且与PDLSCs-CM进行比较,为GMSCs-CM的应用提供理论依据。研究方法:浓缩CM的制备:取临床健康的人牙龈组织,组织块法培养并传代获得人牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts,GFs),有限稀释法克隆化分离培养获得GMSCs,PDLSCs是张春澍同学慷慨相赠。上述细胞在生长培养基MEM中生长至融合后,换用无血清MEM继续培养48小时,收集各组无细胞、无血清的条件培养液,超滤离心管浓缩100倍,BCA法测定各组蛋白质浓度。大鼠牙周缺损模型的建立及分组处理:外科方法建立大鼠左侧下颌第一磨牙颊侧牙周骨缺损模型,Bio-gide胶原膜负载各组条件培养液,移植至牙周缺损,严密缝合。共分为五组:对照组,仅放置胶原膜;无血清培养基组(MEM组),胶原膜负载不含血清的浓缩α-MEM;GFs-CM组,胶原膜负载牙龈成纤维细胞浓缩条件培养液;GMSC-CM组:胶原膜负载牙龈干细胞浓缩条件培养液;PDLSCs-CM组:胶原膜负载牙周膜干细胞浓缩条件培养液。标本处理及分析:分别于术后1周、2周、4周处死动物,取左侧下颌第一磨牙及牙周组织,脱钙,石蜡包埋,进行HE及Masson染色,组织学观察并测量,统计学分析各组牙周再生的情况。进行肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、-10 的免疫组化染色及分析,分析各组炎症因子表达情况。对各组标本进行骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、Runt有关转录因子-2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),免疫组化染色,以分析成骨细胞分化情况。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：
消毒铺巾。注射适量甲哌卡因局部浸润后，沿左侧下颌骨下缘做一长约逡逑１．５ｃｍ的口外切口，分离皮下筋膜，暴露咬肌，切断咬肌筋膜，剥离骨膜，翻开逡逑暴露骨面（图１Ａ），避免损伤重要的血管、神经。用涡轮机手机仔细地磨除下逡逑颌从第一磨牙近中至第二磨牙近中的颊侧牙槽骨，冠方去除至牙槽嵴顶，根方到逡逑达根尖区，彻底刮除根面牙周膜、牙骨质，建立一个长、高３＿＊２＿牙周缺逡逑损，深约１ｍｍ邋（图１Ｂ），手术过程中用大量生理盐水冲洗术区。无菌棉球吸千，逡逑根据分组，分别将负载各组浓缩条件培养液，即ＭＥＭ，ＧＦｓ－ＣＭ，ＧＭＳＣｓ－ＣＭ，逡逑ＰＤＬＳＣｓ－ＣＭ，以及无菌生理盐水的胶原膜植入缺损内（图１Ｃ）。咬肌复位，５－０逡逑缝线缝合肌层，复位皮肤采用３－０的缝线缝合，再次碘伏消毒伤口。术后密切观逡逑１３逡逑
逦山东大学硕士学位论文逦逡逑结果逡逑１．１逦ＧＭＳＧｓ分离、培养及鉴定逡逑１．１．１逦ＧＭＳＣｓ的分离与培养逡逑组织块培养７到１０天左右可观察到组织块周围有长梭形细胞生长，围绕组逡逑织块向周围扩展，增殖快速（图２Ａ）。高倍镜下，细胞呈成纤维细胞形态，细胞逡逑核居中（图２Ｂ）。有限稀释单个细胞约５天开始形成包含多个细胞的集落，细胞逡逑形态相似，呈长梭形，细胞增殖迅速，约２周时，集落中心细胞密集，呈菊花状，逡逑向周围放射排列（图２Ｃ）。２周时结晶紫染色，可见培养皿底部多个淡蓝色斑点逡逑（图２Ｄ），邋ＧＭＳＣｓ的克隆形成率为２２％土２．９％。逡逑
逡逑１．邋１．２．邋２邋ＧＭＳＣｓ多向分化潜能检测：经成骨培养基诱导培养２８天后，ＧＭＳＣｓ呈逡逑多层生长，茜素红染色可观察到钙结节（图３Ｂ）。ＧＭＳＣｓ经成脂培养基培养诱导逡逑１４天后，油红染色可见红色的脂肪微粒（图３Ｃ），显示ＧＭＳＣｓ具有向成脂肪细逡逑胞分化的能力。逡逑Ａ邋Ａ０１邋ｃｏｎｔｒｏｌ逦Ａ０２ＣＯ－３４逦Ａ０３邋ＣＯ－４５逡逑ｇ邋0ｍ邋Ｐｔ邋逦邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１逦邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１逡逑＾邋＾邋＾邋Ｊｉ邋＾邋＾邋Ｊｌ逦＾邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋＾逡逑ＰＥ邋Ａ逦ＰＣ邋Ａ逦Ｘ．Ａ逡逑Ａ０４ＣＯ－９０逦Ａ０６邋ＣＯ－４４逦Ａ0５邋ＣＤ－１０５逡逑｜邋０＾邋Ｐｔ逦邋｜邋０0？邋Ｐ１逦邋Ｉ邋Ｑ？ｔｅ邋Ｐｉ逦逦逡逑？邋Ｉ邋！逦？邋Ｉ逡逑ｊｙｉ逡逑Ｊ？Ｏｋｌ邋．ＵＫ邋．邋．Ｊ？Ｊｕ逡逑＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ２逦＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋Ｊｉ逡逑＿＿：}瑁咤危沐澹渝义贤迹冲澹牵停樱茫蟾上赴约ㄥ义希粒毫魇较赴跫觳猓牵停樱茫蟊砻姹曛疚锏谋泶铮唬拢哄澹牵停樱茫蟪晒桥嘌觳舛嘞蚍皱义匣蹦埽晒怯盏寂嘌玻柑欤嘌蟮撞啃纬傻能缢睾旖峤阱澹浚矗欤埃埃弧⒊慑义现盏迹洛澹牵停樱茫缶芍盏寂嘌保刺
本文编号：2820349
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：
消毒铺巾。注射适量甲哌卡因局部浸润后，沿左侧下颌骨下缘做一长约逡逑１．５ｃｍ的口外切口，分离皮下筋膜，暴露咬肌，切断咬肌筋膜，剥离骨膜，翻开逡逑暴露骨面（图１Ａ），避免损伤重要的血管、神经。用涡轮机手机仔细地磨除下逡逑颌从第一磨牙近中至第二磨牙近中的颊侧牙槽骨，冠方去除至牙槽嵴顶，根方到逡逑达根尖区，彻底刮除根面牙周膜、牙骨质，建立一个长、高３＿＊２＿牙周缺逡逑损，深约１ｍｍ邋（图１Ｂ），手术过程中用大量生理盐水冲洗术区。无菌棉球吸千，逡逑根据分组，分别将负载各组浓缩条件培养液，即ＭＥＭ，ＧＦｓ－ＣＭ，ＧＭＳＣｓ－ＣＭ，逡逑ＰＤＬＳＣｓ－ＣＭ，以及无菌生理盐水的胶原膜植入缺损内（图１Ｃ）。咬肌复位，５－０逡逑缝线缝合肌层，复位皮肤采用３－０的缝线缝合，再次碘伏消毒伤口。术后密切观逡逑１３逡逑
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逡逑１．邋１．２．邋２邋ＧＭＳＣｓ多向分化潜能检测：经成骨培养基诱导培养２８天后，ＧＭＳＣｓ呈逡逑多层生长，茜素红染色可观察到钙结节（图３Ｂ）。ＧＭＳＣｓ经成脂培养基培养诱导逡逑１４天后，油红染色可见红色的脂肪微粒（图３Ｃ），显示ＧＭＳＣｓ具有向成脂肪细逡逑胞分化的能力。逡逑Ａ邋Ａ０１邋ｃｏｎｔｒｏｌ逦Ａ０２ＣＯ－３４逦Ａ０３邋ＣＯ－４５逡逑ｇ邋0ｍ邋Ｐｔ邋逦邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１逦邋｜邋ＯＨ邋Ｐ１逡逑＾邋＾邋＾邋Ｊｉ邋＾邋＾邋Ｊｌ逦＾邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋＾逡逑ＰＥ邋Ａ逦ＰＣ邋Ａ逦Ｘ．Ａ逡逑Ａ０４ＣＯ－９０逦Ａ０６邋ＣＯ－４４逦Ａ0５邋ＣＤ－１０５逡逑｜邋０＾邋Ｐｔ逦邋｜邋０0？邋Ｐ１逦邋Ｉ邋Ｑ？ｔｅ邋Ｐｉ逦逦逡逑？邋Ｉ邋！逦？邋Ｉ逡逑ｊｙｉ逡逑Ｊ？Ｏｋｌ邋．ＵＫ邋．邋．Ｊ？Ｊｕ逡逑＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋＾邋Ｊ２逦＾邋＾邋Ｊ邋＾邋＾邋＾邋Ｊ＞邋Ｊｉ逡逑＿＿：}瑁咤危沐澹渝义贤迹冲澹牵停樱茫蟾上赴约ㄥ义希粒毫魇较赴跫觳猓牵停樱茫蟊砻姹曛疚锏谋泶铮唬拢哄澹牵停樱茫蟪晒桥嘌觳舛嘞蚍皱义匣蹦埽晒怯盏寂嘌玻柑欤嘌蟮撞啃纬傻能缢睾旖峤阱澹浚矗欤埃埃弧⒊慑义现盏迹洛澹牵停樱茫缶芍盏寂嘌保刺
本文编号：2820349
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