人舌鳞癌细胞株Tca8113中侧群细胞的分离及体外增殖成瘤能力的初步分析

发布时间：2020-09-21 12:26

　　本文检测和分选人舌鳞癌细胞株Tca8113中的侧群细胞(side population cells ,SP cells),并对其体外增殖、致瘤能力进行初步分析。以考察人舌鳞癌细胞株Tca8113中的侧群细胞是否具有类肿瘤干细胞的生物学特性,为舌鳞癌中肿瘤干细胞的有效富集策略提供新的方案。 1. Tca88813细胞株Hoechest33342染色及流式细胞技术SP细胞分选方法:将人舌鳞癌细胞株Tca8113培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基完全培养液中,置于5%CO2,3 7℃饱和温度的培养箱中培养,每日换液当细胞生长到铺满瓶底80%时加完全培养液按1:2或1:3传代培养。取数瓶已培养的细胞,细胞总量为108数量级。①以0.01%P B S冲洗,适量0.125%胰酶消化,中止消化后,HBSS(8g/L Nacl, 0.4g/L Kcl, 1g/L葡萄糖, 60mg/L KH2PO4, 47.5 mg/L Na2HPO4,调pH至7.2.)洗涤,重悬,离心,弃上清。②Hoechest33342染色,将1ml/ml的Hoechest33342及维拉帕米加入单细胞悬液中,使其Hoechest33342终浓度为5μg/ml。3 7℃恒温水浴90分钟,并时常晃动充分混匀;③90分钟后, 4℃低温离心500r/min,10min;收集沉淀,在4℃用含2 /ml碘化丙啶(PI)的HBSS平衡盐溶液平衡沉淀即为染色好的细胞(PI目的为标记死细胞);④流式细胞仪检测分选,激发光波长为350nm,采集波长为450nm和675nm(分选前标本保持在4℃),上机分选,发光偏弱的就是SP细胞。结果:Hoechest33342染色后,对照组加入维拉帕米拮抗,通过流式细胞仪分选到Tca8113中的SP细胞约占总细胞数量0.8%。实验结果表明,人舌鳞癌细胞株Tca8113中含有微量的SP细胞。 2.甲基偶氮唑蓝( MTT)法检测SP细胞体外增殖能力方法:将分选的SP细胞,MP细胞以及未分选的细胞种植于9 6孔板内,每孔加用0.2ml含20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng /ml表皮生长因子(EGF)、5μg/ml胰岛素的的无血清培养液,2000细胞/孔(设空白组用于调零)。置于5%CO2,37℃饱和温度的培养箱中培养,每2 d换液1次,在第1、3、5、7d用MTT比色法测定细胞的增殖状态,以490nm吸光度(A)值量化活细胞数,每组所得数据取均值,绘制细胞生长曲线,比较3组细胞的增殖速度。结果:分选出的SP细胞,立即在无血清培养基中培养,细胞呈单细胞、球形、悬浮生长。随着培养时间延长,细胞呈团块状生长体积逐渐增大,细胞数量增多,培养5d后,细胞呈葡萄串状生长,肿瘤球形成。将悬浮细胞离心,用含10%小牛血清的RPMI1640培养,24h后细胞贴壁生长。而根据MTT比色法于测定吸光度(A)值显示,在无血清培养基中,SP细胞与MP细胞以及未分选细胞相比,有较强的体外扩增能力,且1-3d及5-7d时更为显著。实验结果证明了Tca88813细胞株中的SP细胞具有类肿瘤干细胞的体外扩增能力。 3.SP细胞及未分选细胞裸鼠皮下接种动物模型建立方法:选取24只8周龄雌性NOD/SCID小鼠作为实验对象,随机分为两组组(即SP及未分选组)每组12只,各组内随机分成A、B、C、D4个小组,分别给予背部皮下细胞接种,数量级分别为103 104 105 106/ml,注射后于无菌饲养间内饲养,观察裸鼠成瘤情况。结果:103数量级的SP及未分选细胞接种的裸鼠,均未成瘤。接种13d后, 105、106数量级的SP接种裸鼠背部出现瘤体,14d后104数量级SP细胞及106数量级未分选细胞接种的裸鼠背部出现瘤体。28d后,瘤体直径均达到1-1.3cm。实验结果表明,Tca88813细胞株中的SP细胞具有类肿瘤干细胞的高成瘤能力。研究结果表明,舌癌中的SP细胞可作为舌癌干细胞富集策略之一。人舌鳞癌中存在类肿瘤干细胞,并具有自我更新及高致瘤性。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R739.86
【部分图文】：

维拉帕米,拮抗,对照组

附图Hoechest33342染色组↓（H）对照组维拉帕米拮抗组↓（H+V）图1 流式细胞仪分选结果Fig.1 Results of flow cytometry isolation

无血清培养,细胞体,细胞分选,分选

图2 SP细胞体外无血清培养Fig.2 Culture the SP cells in serum-free mediumRPMI1640 culture solution1.细胞分选后1天，单个细胞悬浮生长；2.细胞分选后2天，细胞数量逐渐增多，呈团块状生长；3.分选后4天，细胞数量继续增多，呈葡萄串状生长；4.分选后5天，细胞数量增加体积增大，肿瘤球形成；5. 将悬浮细胞离心，用含10％小牛血清的RPMI1640培养，24h后细胞贴壁生长。

情况,裸鼠,数量级,分选

A BC D图3 各组裸鼠成瘤情况Fig.3 Tumorigenicity of mice in defrent groupsafter hypodermic inoculationA．103数量级的SP及未分选细胞接种裸鼠；B．104、 105数量级的SP接种裸鼠；C．106数量级SP细胞及未分选细胞接种的裸鼠；D．大体观瘤体呈灰白色，表面呈结节状。

【参考文献】