Snail诱导口腔癌细胞上皮间质转化并促其获得肿瘤干细胞样特性的实验研究

发布时间：2020-09-21 11:47

　　 口腔黏膜鳞癌(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC，简称口腔癌)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，局部复发和颈淋巴结转移是其致死的主要原因。近年来，上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)在恶性肿瘤侵袭转移过程中可能发挥关键作用受到广泛关注。研究发现Snail通过抑制E-cadherin表达在EMT过程中起核心调控作用，是其关键调节因子。 目的：本研究通过构建pEGFP-N1-Snail真核表达质粒，检测过表达Snail的口腔癌细胞SCC9的生物学特性变化，探讨Snail在口腔癌细胞EMT及侵袭转移过程中的作用；在此基础上进一步验证过表达Snail的口腔癌细胞是否获得肿瘤干细胞(cancerstemcell,CSC)样特性。 方法：成功构建pEGFP-N1-Snail真核表达质粒。分别抽提pEGFP-N1及pEGFP-N1-Snail质粒，用脂质体2000(Lipofectamine2000)转染SCC9肿瘤上皮细胞，通过G418筛选，获得稳定表达细胞株SCC9-N（对照组）及SCC9-S（实验组）。通过实时定量(QuantitativeReal-TimePCR,qPCR)，免疫蛋白印迹技术(WesternBlotting)，免疫荧光显微方法(ImmunofluorescenceMicroscopy)检测对照组和实验组细胞中E-钙粘蛋白(E-cadherin)，-连环蛋白(-catenin)，Snail，波形蛋白(vimentin)相关基因和蛋白的表达水平。应用划痕实验(Wound-HealingAssay)，侵袭实验(InvasionAssay)，粘附实验(AdhesionAssay)检测细胞侵袭和转移能力。另外，通过细胞流式技术(FlowCytometry)及单克隆形成实验(Colony-FormingAssay)检测转染后的肿瘤细胞获得了干细胞样特点。 结果：成功构建了pEGFP-N1-Snail真核表达质粒，将pEGFP-N1及pEGFP-N1-Snail分别转染SCC9肿瘤上皮细胞,获得稳定表达细胞株SCC9-N（对照组）及SCC9-S（实验组）。过表达Snail诱导SCC9细胞发生了EMT，细胞形态从上皮样向成纤维样改变，典型的铺路石状向长梭形转变，细胞间变得松散，粘附能力减弱。上皮标记物E-cadherin和-catenin表达下降，而间质标记物vimentin表达上升，细胞侵袭和转移能力增强。更重要的是，Snail不仅诱导SCC9细胞发生了EMT，同时使这些间质细胞具有了CSC样特点，虽然细胞的侵袭能力增强，但是增殖能力却是减弱了，细胞不能向划痕处迁移，处于S期的细胞比例减少，形成的克隆较对照组减少，但SCC9-S细胞仍具有自我更新能力，能形成新的克隆，同时表达相关CSC标记物，CD24在SCC9-S细胞中表达明显下降，CD44在两组细胞中均为高表达，而CD133在两组细胞中均不表达，SCC9-S细胞为CD133-, CD44high/CD24low， SCC9-N细胞为CD133-,CD44high/CD24+。 结论：本实验成功构建了pEGFP-N1-Snail真核表达质粒，并获得了增强表达Snail的稳定细胞株，Snail作为转录抑制因子能诱导SCC9细胞发生EMT，并使间质细胞具有了CSC样特点。进一步证实了Snail在口腔癌侵袭转移过程中的重要作用。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R739.8

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本文编号：2823447