竹红菌乙素光动力对人舌鳞癌Tca8113细胞杀伤作用的初步研究

发布时间：2020-09-21 10:26

　　目的： 1.直接检测竹红菌乙素HB溶在DMSO溶液中并稀释在RPMI-1640培养液中的吸收波长，选择适合本实验的波长的激光仪。 2.初步探讨在PDT作用下竹红菌乙素HB对人舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤抑制作用,并通过一定实验方法了解细胞死亡机制。方法：第一部分药品处理：将进口成品HB粉末10mg全部取出，先用10mlDMSO溶剂将其全部充分溶解，配制成浓度为1mg/ml棕黄色的A液。然后吸取适量A液在100ML含10%FBS的RPMI-1640培养液中混匀，将其稀释成HB终浓度为0.5μM的测试液，测试在室温下进行。用BECKMAN DU series600紫外可见分光光度计对测试液进行扫描，范围为400nm至700nm，扫描后可得出HB的吸光度值A值及吸收波长曲线图。以最大A值对应的波长值定为最适实验波长。第二部分1.细胞培养：Tca8113细胞常规培养，培养基为10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于孵箱（5%CO2、37.0℃恒温）中孵育，培养3-4天后传代或冻存。2.实验时一般选对数生长期细胞，常规消化后均匀吹打，使其成为单细胞悬液，用细胞计数板调整细胞密度为1×106个/ml，按实验要求接种于96孔培养板中，每孔200μl，即每孔细胞量约为2×10~5个，培养板继续放入孵箱内孵育24h（隔夜）,第二日细胞完全贴壁后吸出上清液。各孔中分别加入含不同预设浓度HB的RPMI-1640培养液（不含胎牛血清）又继续孵育4h,然后在不同预设激光能量密度的激光（波长为470nm）下垂直照射后，再孵育24h，最后用MTT法（λ=490nm）检测各孔的OD值，测试重复3次，根据均值代入公式计算细胞杀伤抑制率。3、选取实验细胞同2，选用12孔培养板，每孔接种量为1ml。然后经同样的孵育及PDT光照处理后，用于光学倒置显微镜下观察，同时用Hochst33258染色法在荧光显微镜下观察细胞形态变化；另外，用Annexin-V-FITC/PI双染法对各组细胞处理后上流式细胞仪定量检测分析细胞凋亡率（1h内）。结果：第一部分HB的RPMI-1640培养液测试液出现3个吸收峰，峰值位于475nm、545nm、585nm，且可见对应475nm处的峰值明显高于其他2处。第二部分1.对照组单加HB药物组与单纯PDT组对细胞均无明显杀伤抑制作用。2.HB-PDT细胞组在不同剂量的激光能量密度下对细胞均有不同的杀伤抑制作用，且在一定范围内，随着药物浓度和光照强度增加，其杀伤作用也显著增强，呈正相关关系。3.HB浓度和PDT强度为中度时，PDT处理6h后其细胞死亡机制多以凋亡为主。结论： 1. HB的DMSO溶液在RPMI-1640培养液中在475nm处出现最大吸收峰值，说明波长为接近475nm的激光能使竹红菌素发挥最大的光动力效应，因此本实验选用固定输出波长为470nm的激光仪进行实验。 2. HB在PDT作用下对体外人舌鳞癌Tca8113细胞有明显的抑制作用，且在一定范围内与HB浓度和PDT强度呈正相关关系。 3．HB本身对Tca8113细胞的抑制效果不强，但联合PDT作用后则显著增强，说明竹红菌乙素HB具有显著地光动力性质；这种抑制作用机制主要是通过诱导细胞凋亡实现的。另外，PDT作用后6h即能检测出较高的细胞凋亡率，说明竹红菌素HB具有较高的光动力作用效率。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R739.86
【部分图文】：

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【参考文献】