Mimic-miR-503和Inhibitor-miR-144联合转染对脂肪干细胞成骨分化的影响

发布时间：2020-09-22 11:20

　　目的1.对比原代细胞BMSCs、ADSCs细胞增殖能力,成骨、成脂分化能力,选择合适的干细胞作为本实验的研究细胞。2.观察在成骨诱导环境下,脂肪干细胞内miR503、miR144的表达情况。3.检测Mimic-miR503、Inhibitor-miR144促进ADSCs成骨分化,Mimic-miR503、与Inhibitor-miR144联合转染对ADSCs成骨分化具有协同作用。方法提取SD大鼠原代BMSCs和ADSCs,通过显微镜下比较细胞的形态;细胞流式检测细胞表型;P3代细胞计数,检测细胞的增殖能力并绘制生长曲线;成骨诱导进行ALP染色、茜素红染色、成脂诱导行油红O染色;qRT-PCR检测成骨、成脂相关基因比较两组细胞的成骨成脂分化能力。P3代ADSCs成骨诱导组和空白对照组,利用qRT-PCR检测miR503和miR144相对表达量。miRNA数据库Target Scan(http://www.target scan.org)预测miRNA503-5p和miRNA144-5p相关作用靶点,miRNA503-5p靶向成骨基因主要包括:WNT3ɑ、ATK3、SMAAD7、WNT4,miRNA144-5p靶向成骨基因主要包括:TFG、SMAD6、SMAD5、SMAD1、WNT2、WNT5α、WNT7α、BMP10、MMP13等。体外转染Mimic-miR503(M组)、Inhibitor-miR144(I组)、Mimic-miR503和Inhibitor-miR144混合物(M+I组)、实验对照组(NC组),实现miR503的过表达和miR144低表达;细胞流式检测ADSCs的细胞表型;MTT检测四组ADSCs的增殖能力并绘制相关生长曲线;ALP染色、qRT-PCR、Western Blot检测各组的成骨标志物。结果BMSCs、ADSCs均可稳定传代至P10代,细胞形态均一,稳定;均具有成骨、成脂分化能力;细胞增殖实验显示P3代ADSCs的增殖能力强于BMSCs(P0.05)。QRT-PCR显示:ADSCs成骨诱导组与空白对照组相比,miR503表达量升高50倍,miR144表达量降低2倍。M组、I组、M+I组分别相对于NC组,ALP染色强度较强(116.623±3.02%,117.9753±2.97%,141.2263±3.59%)。与M组、I组相比,M+I组ALP染色强度较强(25.7230±2.73%,24.5267±2.53%)。qRT-PCR检测成骨相关基因,M组、I组、和M+I组细胞中的所有成骨相关基因(RUNX2、BSP、OCN)的表达水平均明显高于NC组的表达水平,M+I组细胞中的成骨相关基因(RUNX2、BSP)的表达水平则明显高于M组和I组的表达水平,且M组与I组之间没有明显差异。结论相对于BMSCs,ADSCs具有来源广泛,增殖能力强,具有骨向分化能力,ADSCs可为本实验成骨分化的研究细胞。miR503、miR144可能参与调控ADSCs成骨分化。M+I组成骨能力强于M组、I组,转染组成骨能力都强于阴性对照NC组。Mimic-miR503活化经典Wnt/β-catenin通路、Inhibitor-miR144活化SMAD信号通路促进ADSCs骨向分化,Mimic-miR503和Inhibitor-miR144协同促进骨向分化。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R78
【部分图文】：

生长曲线,形态特征,细胞的,大鼠

图1：P3和P10 BMSCs和ADSCs两组细胞的形态特征。A.分离培养得到的大鼠BMSCs（P3）;B.分离培养得到的大鼠ADSCs(C.传代培养大鼠BMSCs（P10）;D.传代培养大鼠ADSCs（P10)二、BMSCs和ADSCs生长曲线该生长曲线可简单的分为：细胞经过数分钟的悬浮期随后贴壁，经同的潜伏期；随后进入细胞对数增长期；细胞密度达到饱和时，即达到然后退化消亡期。图2结果可看出BMSCs前2d生长速度稍快于ADSCs，但的生长速度明显快于BMSCs，两组细胞在第6d时到稳定期，BMSCs总数仅的6倍，而ADSCs总数为起始时的10倍。

曲线,曲线,分化能力,表达率

17图2：P3代 BMSCs和ADSCs增殖曲线呈典型的“S”形（P＜0.01，**表示）三、流式细胞术检测细胞表面标记物结果流式结果图 3 显示：P3BMSCsCD34（造血干细胞的表面标志）和 CD45（白细胞表面抗原）表达率较低分别为 1.73%和 0.58%，CD29 和 CD90(间充质干细胞表达标志蛋白)表达率在 95%以上，强阳性。P3ADSCs 也表现出相似的 CD34、CD45 低表达和 CD29、CD90 的强阳性表达。图 3：p3 BMSCs 和 ADSCs 表面抗原标记物的表达四、碱性磷酸酶染色结果两组细胞诱导组和空白对照组进行ALP染色（见图4），以胞浆内含有蓝色颗粒为阳性反应。发现，两组细胞成骨诱导组蓝色沉淀明显多于空白对照组，说明两组细胞均有骨向分化能力，BMSCs骨向分化能力强于ADSCs。

曲线,表面抗原,标记物,表达率

图2：P3代 BMSCs和ADSCs增殖曲线呈典型的“S”形（P＜0.01，**表示）三、流式细胞术检测细胞表面标记物结果流式结果图 3 显示：P3BMSCsCD34（造血干细胞的表面标志）和 CD45（白细胞表面抗原）表达率较低分别为 1.73%和 0.58%，CD29 和 CD90(间充质干细胞表达标志蛋白)表达率在 95%以上，强阳性。P3ADSCs 也表现出相似的 CD34、CD45 低表达和 CD29、CD90 的强阳性表达。

【参考文献】