伴放线放线杆菌CDT蛋白亚基CdtA功能研究

发布时间：2020-09-22 11:22

　　细胞致死性扩张毒素(cytolethal distending toxin,CDT)是一种新发现的由某些G-致病菌分泌的特殊的细菌毒素,能够引起上皮细胞、成纤维细胞和淋巴细胞细胞周期G2/M期阻滞。伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa )是局限型侵袭性牙周炎的主要可疑致病菌,也是目前发现的唯一能表达CDT的口腔细菌。CDT由CdtA、CdtB和CdtC组成,CdtB已被证明是毒性亚基,但CdtA和CdtC的功能尚不明确。 [目的]通过细胞毒性实验筛选毒性缺陷、缺失的突变位点,明确维持CdtA活性正常发挥的关键氨基酸基团,探讨Aa CdtA结构和功能的关系。 [方法]以Aa ATCC 29522基因组DNA为模板,采用PCR法获得野生型cdtA、cdtB、cdtC基因,经双酶切、连接的定向克隆技术构建原核表达载体。以构建好的野生型pET-15b-cdtA质粒DNA为模板,采用定点突变技术获得突变型pET-15b-cdtAY105A、pET-15b-cdtAY181A、pET-15b-cdtAY125A。IPTG诱导蛋白表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot检测并鉴定蛋白表达。Ni-HisTrap HP预装柱对各重组蛋白进行体外纯化,纯化重组的CdtB体外与超螺旋质粒(pET-32a)DNA孵育,观察其生物学活性,判定各重组蛋白是否具有生物学活性。野生型和突变型CdtA分别与野生型CdtB、CdtC等量混合于重构缓冲溶液,分别与Hela细胞和CHO共孵育,MTT检测Hela细胞增殖抑制效应、克隆形成数目cfu(colony-forming units)计算活细胞数;倒置相差显微镜观察Hela细胞致死性扩张的形态学改变;流式细胞仪分析Hela细胞周期阻滞情况。 [结果]经测序鉴定,构建的野生型原核表达载体pET-15b-cdtA、pET-15b-cdtB、pET-15b-cdtC转染的感受态大肠杆菌均各自携带有cdtA、cdtB、cdtC基因,且基因片段与GenBank中已收录的Aa cdtA、cdtB、cdtC基因序列一致性高达99%。构建的突变型原核表达载体pET-15b-cdtAY105A、pET-15b-cdtAY181A、pET-15b-cdtAY125A突变位点完全正确。Western blot观察到带有His6-tag标记的目的蛋白CdtA、CdtB、CdtC、CdtAY105A、CdtAY181A、CdtAY125A。单独的野生型CdtA、CdtB和三个突变型CdtAY105A、CdtAY181A、CdtAY125A蛋白对细胞生长均无抑制作用。单独的CdtC蛋白和野生型CDT全毒素具有细胞致死性扩张的生物学活性。与野生型CDT全毒素相比,突变型全毒素CdtAY105ABC的生物学活性明显降低,突变型全毒素CdtAY181ABC的生物学活性略有增强,突变型全毒素CdtAY125ABC的生物学活性相比没有明显变化。 [结论]本研究成功获得了体外重组的野生型CDT和突变型CDT全毒素,初步筛选获得Aa CdtA的两个潜在功能位点CdtAY105A、CdtAY181A,为进一步研究CdtA的结构和功能奠定基础。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：

琼脂糖凝胶电泳,脱氧核糖核酸酶,体外复性,成功性

南京证实CdtB 具有DNase I 样功能。故可活性来推定各重组蛋白体外复性成功性后CdtB 与超螺旋质粒pET-32a DNA7.0）,10mM Mgcl2,5mM Cacl2）37℃孵脱氧核糖核酸酶样生物学活性,未经处16s rRNA PCR 鉴定的电泳结果糖凝胶电泳，可见大小为557bp 的特异实该细菌为 Aa(图1-1) 。

琼脂糖凝胶电泳,中间载体,琼脂糖,测序

图1-2 PCR 扩增目的基因片段的1%琼脂糖凝胶电泳1 DL 2000Marker；2-4 分别为cdtA、cdtB、cdtC 基因大小约为669bp、852bp、561bp）电泳及测序结果9-T 中间载体的各基因片段PCR 产物经1%琼脂糖p、716bp 大小的条带，与预期片段大小一致（图

电泳图,电泳图,琼脂糖凝胶电泳,片段

（4）重组质粒电泳及测序结果连接上pMD19-T 中间载体的各基因片段PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分别可见824bp、1007bp、716bp 大小的条带，与预期片段大小一致（图1-3）。图1-3 重组原核表达载体pMD19-T-cdtA、pMD19-T-cdtB、pMD19-T-cdtC 1%电泳图片(1 DL2000Marker 2 分别为pMD19-T-cdtA、pMD19-T-cdtB、pMD19-T-cdtC（从左至右）连接上 pET-15b 原核表达载体的各基因片段PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分别可见935bp、1118bp、827bp 大小的条带，与预期片段大小一致（图 1-4）。图1-4 重组原核表达载体pET-15b-cdtA、pET-15b-cdtB、pET-15b-cdtC 1%电泳图片(1 DL2000Marker 2 分别为pET-15b-cdtA、pET-15b-cdtB、pET-15b-cdtC（从左至右）)

【参考文献】