星孢菌素对山羊颞下颌关节盘细胞自组装基体收缩性的影响

发布时间：2020-09-29 06:33

　　目的:探索不同浓度的星孢菌素对山羊颞下颌关节盘细胞自组装基体两周内的收缩性及细胞外基质合成的影响。方法:1.体外分离山羊颞下颌关节盘,Ⅰ型胶原酶过夜消化,提取关节盘细胞;单层培养山羊颞下颌关节盘细胞。甲苯胺蓝染色和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色鉴定P3代细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的分布。2.利用24孔板制作直径为5mm,深度为10mm的圆柱形琼脂糖模具;每个琼脂糖井用完全培养基连续换液一周。3.收集P3代关节盘细胞,以5.5×10~6个细胞按照对照组和不同浓度的星孢菌素(Staurosporine)组(0.1nM,1nM,10nM,100nM)种入每个琼脂糖井,每天每井相应换液,培养至一周和两周。4.观察自组装基体的形态变化;冰冻切片做天狼猩红染色展示胶原分布,番红染色显示糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)的分布;免疫组织化学染色显示Ⅰ型胶原、及α-肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)的分布;ELISA和Blyscan试剂盒检测不同时间段细胞外基质含量的变化。结果:1.光学显微镜下P0,P1,P2及P3代的不同代次细胞形态:从P0代到P3代,细胞形态逐渐变为扁平的长梭形和多边形,其中P3代细胞形态明显粗大。P3代细胞甲苯胺蓝染色和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色为阳性,显示细胞外基质糖胺聚糖(GAGs)和Ⅰ型胶原的合成。2.星孢菌素组和对照组细胞均在琼脂糖井内自组装成球形,一周内各组基体都有收缩现象,两周内基体形态变化基本稳定;其中,10nM星孢菌素组直径和湿重最大(P0.01);两周时各组基体湿重有增加,但直径增加不是很明显(P0.01)。3.一周和两周冰冻切片染色显示:各组基体天狼猩红,番红及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色为阳性,星孢菌素组更明显,尤其10nM组为强阳性;而星孢菌素组相对于对照组α-SMA免疫组织化学染色为弱阳性。4.ELISA检测的自组装基体内的Ⅰ型胶原含量和Blyscan试剂盒检测的GAGs含量显示星孢菌素组高于对照组,其中10nM组最明显(P㩳0.01);另外,各组基体在两周时细胞外基质的含量高于一周组(P0.01)。结论:不同浓度星孢菌素对于预防自组装基体的收缩有一定效果,但不是非常突出,它更有利于自组装基体细胞外基质的合成。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R782.6
【部分图文】：

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培养及自组装模具下获取山羊颞下颌关节盘组织（图 1），Ⅰ型胶原酶）（图 1），原代山羊颞下颌关节盘细胞在一周左右 80%-90%；之后，细胞的生长速度是加快的，约四到 P0，P1，P2 及 P3 代的不同代次细胞（图 2）形态P3 代明显为粗大，扁平的长梭形和多边形，且数量染色（GAGs）及免疫组化染色（Ⅰ型胶原）均为节盘细胞胞外基质。粘接钢柱后，制作琼脂糖井，并且完全培养基换液

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a. a. 山羊颞下颌关节盘细胞 P0 代；b. P1 代；c. P2 代；d. P3 代；e. P3 代甲苯胺蓝染色；f. P3 代Ⅰ型胶原免疫组织化学染色图 2 山羊颞下颌关节盘细胞 100a. 粘接钢珠柱；b. 24h 琼脂糖井；c. 一周琼脂糖井图 3 自组装模具制作

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20a. 粘接钢珠柱；b. 24h 琼脂糖井；c. 一周琼脂糖井图 3 自组装模具制作6.2 自组装基体形态观察山羊颞下颌关节盘细胞接种到琼脂糖井内后，4h 后可见对照组和星孢菌素组的细胞在井底琼脂糖表面形成圆盘状结构(图 4)，乳白色，直径约（5.0±0.3）mm，24h-96h 中形态（图 5）为成圆球状，并且直径逐渐缩小，一周时对照组和星孢菌素组直径有差异（图 6）；星孢菌素组自组装基体的直径、湿重（表 1）比对照组大（P㩳0.01）。星孢菌素组较对照组收缩小，并且 10nM 组形态为凹

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