LEO对不同糖浓度下Streptococcus mutans产酸及调节机制的影响

发布时间：2020-09-30 15:53

　　目的:探讨柠檬精油(Lemon essential oil,LEO)对不同葡萄糖浓度下变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)产酸及其调节机制的影响,为LEO在口腔疾病防治中的应用提供理论依据。方法1.最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定采用液体稀释法测定LEO对0%、0.2%、1%和5%葡萄糖浓度下S.mutans的最小抑菌浓度。2.产酸实验根据测得的MIC,分别用0%、0.2%、1%和5%糖浓度的TPY培养基对LEO对倍稀释,每种糖浓度下设置4个稀释浓度,每个稀释浓度设置3个重复,不含LEO的培养基(四种糖浓度)作为对照组。检测各组含S.mutans溶液的初始pH值,37℃下厌氧培养24h,再次检测各组样本的pH值,以ΔpH=pH_(最终)-pH_(初始)来反映LEO对不同糖浓度下S.mutans的产酸能力的影响。3.乳酸脱氢酶活性的测定分组方法同实验2。收集培养18h的S.mutans,冰浴下超声破碎菌体,BCA蛋白定量试剂盒测定各个样本的蛋白质浓度,还原性辅酶Ⅰ氧化法测定各样本乳酸脱氢酶的活性。4.ldh基因转录和翻译量的测定实验分组设计同实验2,每种糖浓度下仅设置3个稀释浓度。将S.mutans加入各组中,37℃下厌氧培养18h后,提取S.mutans的总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增,根据各组2~(-??Ct)值,确定各组S.mutans ldh基因转录量。分别用0%和1%糖浓度的TPY培养基对1×MIC的LEO对倍稀释,每种糖浓度下设置3个稀释浓度,每个稀释浓度设置3个重复,不含LEO的培养基(0%和1%糖浓度)作为对照组。将S.mutans加入各组培养基中,37℃下厌氧培养18h后,采用SDS-PAGE测定ldh基因的翻译量。结果1.MIC测定结果:LEO在0%和5%糖浓度下的MIC为1.125mg/ml,在0.2%和1%糖浓度下的MIC为2.25mg/ml。2.LEO对0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans产酸的影响结果(1)对照组S.mutans产酸的影响结果在对照组,随着葡萄糖浓度的升高(0.2%~5%糖浓度),培养基的ΔpH值逐渐增大,均高于0%糖浓度组,差异均具有统计学意义(F=1913.266,P0.05),说明高浓度葡萄糖更有利于S.mutans产酸。(2)LEO对S.mutans的产酸影响结果在无糖(0%糖浓度)环境下,仅MIC组ΔpH值低于对照组,差异具有统计学意义(F=12.953,P0.05),提示在无糖环境下,亚抑菌浓度的LEO对S.mutans的产酸无影响。在有糖(0.2%~5%糖浓度)环境下,随着LEO浓度的升高,各糖浓度下S.mutans的ΔpH值逐渐降低,除0.563mg/ml(0.2%糖浓度1/4MIC)以下浓度外,所有LEO组的ΔpH值均低于相同糖浓度下的对照组,差异具有统计学意义(F_(0.2%)=197.287,F_(1%)=2229.371,F_(5%)=2603.091,P0.05),提示在一定浓度范围内,亚抑菌浓度的LEO对高糖、中糖和低糖环境下的S.mutans产酸均有抑制作用,作用具有浓度依赖性。3.LEO对0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans乳酸脱氢酶活性的影响结果(1)对照组S.mutans的乳酸脱氢酶活性的影响结果在对照组,随着葡萄糖浓度的升高(0.2%~5%糖浓度),S.mutans的乳酸脱氢酶活性逐渐增大,均高于0%糖浓度组,差异均具有统计学意义(F=335.297,P0.05),提示高浓度的葡萄糖更有利于S.mutans乳酸脱氢酶活性的提高。(2)LEO对S.mutans的乳酸脱氢酶活性的影响结果在无糖(0%糖浓度)环境下,随着LEO浓度的升高,实验组的乳酸脱氢酶活性逐渐降低,各组的乳酸脱氢酶活性均低于对照组,差异均有统计学意义(F_(0%)=60.85,P0.05),提示LEO在无糖环境下可以抑制S.mutans乳酸脱氢酶活性,抑制作用呈现浓度依赖性。在有糖(0.2%~5%糖浓度)环境下,随着LEO浓度的升高,各糖浓度下S.mutans的乳酸脱氢酶活性均逐渐降低,除0.141 mg/ml(0.2%糖浓度1/16MIC)外,实验组的乳酸脱氢酶活性均低于相同糖浓度下的对照组,差异均有统计学意义(F_(0.2%)=78.867,F_(1%)=77.071,F_(5%)=255.594,P0.05),提示在低糖、中糖和高糖环境下,亚抑菌浓度的LEO也可以抑制S.mutans乳酸脱氢酶活性,抑制作用具有浓度依赖性。4.LEO对0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans ldh基因转录和翻译的影响(1)对照组S.mutans ldh的基因转录结果在对照组,随着葡萄糖浓度的升高(0.2%~5%糖浓度),1%和5%糖浓度组S.mutans的ldh基因的转录量高于0%糖浓度组,差异具有统计学意义(F=16.151,P0.05),提示在一定糖浓度下(1%和5%)的葡萄糖可以诱导S.mutans ldh基因的表达上调。(2)LEO对S.mutans ldh基因转录和翻译的影响结果在无糖环境下(0%糖浓度),各实验组ldh的基因转录量均高于对照组,与对照组相比,差异均具有统计学意义(F=14.258,P0.05);0.563 mg/ml(1/2MIC)精油组的ldh基因的翻译量低于对照组,0.282mg/ml(1/4MIC)精油组的ldh基因的翻译量高于对照组,相比对照组,差异具有统计学意义(F=167.193,P0.05),提示在无糖环境下,LEO可能有诱导ldh基因转录上调的作用,对ldh基因翻译具有一定的影响,作用无明显规律。在有糖环境下,除0.563mg/ml(0.2%糖浓度1/4MIC)外,其余实验组ldh的基因转录量均低于对照组,差异均有统计学意义(F_(0.2%)=18.009,F_(1%)=316.667,F_(5%)=36.528,P0.05);实验组的ldh基因合成乳酸脱氢酶的量显著低于对照组,差异具有统计学意义(F_(1%)=709.001,P0.05),提示在有糖环境下,LEO可以抑制ldh基因的转录和翻译。结论1、LEO可以抑制0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans产酸。2、在有糖环境下,亚抑菌浓度的LEO在不影响细菌生长的同时,可以通过抑制S.mutans ldh基因的转录和翻译,降低乳酸脱氢酶的活性,进而减少酸的产生。3、在无糖环境下,亚抑菌浓度的LEO对S.mutans ldh基因的转录可能具有逆调节的作用,对S.mutans ldh基因的翻译具有一定的影响,作用无显著规律。4、高浓度的葡萄糖可以上调S.mutans ldh基因的表达量,提高乳酸脱氢酶的活性,更有利于产酸。5、LEO对无糖环境下S.mutans ldh基因转录的逆调节作用需要从多角度进一步研究证实。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R788.1
【部分图文】：

显微镜下,糖浓度,最小抑菌浓度

图 1-1 S.mutans 显微镜下图（400 倍）。图 1-2 S.mutans 纯培养鉴定图。1.2.2 四种糖浓度下 LEO 的最小抑菌浓度的测定结果液体稀释法测得 LEO 在 5%和 0%糖浓度下的最小抑菌浓度为 1.125 mg/ml，在 1%和 0.2%糖浓度下的最小抑菌浓度为 2.25 mg/ml。LEO 在四种糖浓度下对S.mutans 生长的影响结果见表 1-2。表 1-2 0%、0.2%、1%和 5%葡萄糖浓度下 LEO 对 S.mutans 生长影响结果葡糖糖浓度 LEO 浓度4.5 mg/ml 2.25 mg/ml 1.125 mg/ml 0.563 mg/ml 对照组5% - - - + +1% - - + + +0.2% - - + + +0% - - - + +注：+代表有细菌生长，-代表无细菌生长。

纯培养,鉴定图,糖浓度,最小抑菌浓度

统计学意义,产酸,两两比较,糖浓度

7同葡萄糖浓度下 S.mutans 的产酸结果，G 代表葡萄糖，*代表各组之较，差异有统计学意义（P＜0.05）。对 S.mutans 的产酸的影响结果 LEO 的情况下，0%、0.2%、1%和 5%糖浓度下 S.mutans 1-4。环境下，即 0%糖浓度，随着 LEO 浓度的升高（0.141~1.1的ΔpH 值从 0.360 逐渐降至 0.077，相比对照组，仅 1.1差异具有统计学意义（P＜0.05），提示在 0%糖浓度下, 仅）组LEO对S.mutans产酸具有抑制作用,亚抑菌浓度的LEO作用。环境下：0.2%糖浓度下，随着 LEO 浓度的升高（0.141~1.1的ΔpH 值从 0.580 逐渐降至 0.093，相比对照组，仅 0.56（l1/2MIC 和 1/4MIC）组差异具有统计学意义（P＜0.05），提

【参考文献】