目的： 分别构建含人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）基因的真核表达载体和含人转化生长因子-β1（transforming growthfactor-β1，TGF-β1）基因的真核表达载体，用脂质体介导的方法将这两种真核表达载体转染SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），探讨bFGF与TGF-β1双基因能否共同修饰BMSCs及对它的增殖是否具有协同作用，为联合利用基因工程技术和牙周组织工程技术修复牙槽骨缺损提供初步实验依据。 方法： 通过PCR方法从质粒pDONR223-bFGF、pDONR223-TGF-β1中获得人bFGF和人TGF-β1基因，将这两种目的基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1，用酶切和测序的方法来鉴定重组真核表达载体是否构建成功。分离培养SD大鼠BMSCs，用流式细胞仪鉴定其表面标志物。将构建成功的两种真核表达载体转染BMSCs，RT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白质水平检测BMSCs中bFGF和TGF-β1基因的表达。通过MTT法检测转染后细胞的增殖情况，各组光密度值（OD值）均以均数±标准差（x±s）表示，两两样本均数比较用t检验，应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： （1）真核表达载体pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1经限制性内切酶酶切后，电泳后显示有468bp、1173bp的人bFGF和人TGF-β1目的基因片段及5428bp的线性化pcDNA3.1(+)载体片段。目的基因人bFGF的测序结果与经过优化的人bFGF基因碱基序列基本一致，人bFGF基因于447位有1个碱基突变：G→T，于467位有1个碱基突变：A→G，均为同义突变。目的基因人TGF-β1的测序结果与GenBank中的人TGF-β1基因碱基序列一致，无碱基突变。说明构建的真核表达载体中含有人bFGF和人TGF-β1基因。 （2）真核表达载体pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染SD大鼠BMSCs24h后，通过RT-PCR和Western blot检测到bFGF、TGF-β1基因的表达，其蛋白分子量分别约为18kD和25kD。共转染组中既有bFGF基因的表达也有TGF-β1基因的表达。 （3）真核表达载体pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染SD大鼠BMSCs24h后，对各组MTT OD值进行比较：pcDNA3.1(+)-bFGF组、pcDNA3.1(+)-TGF-β1组、 pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1组、pcDNA3.1(+)组的OD值均高于空白对照组（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-bFGF组、pcDNA3.1(+)-TGF-β1组、pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1组的OD值均高于pcDNA3.1(+)组（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-bFGF组的OD值高于pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1组（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-TGF-β1组OD值与pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1组的OD值比较，P＞0.05，差异没有统计学意义。 结论： （1）真核表达载体pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1构建成功。 （2）真核表达载体pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1能够在SD大鼠BMSCs中表达。bFGF与TGF-β1双基因能够共同修饰SD大鼠BMSCs。 （3）本实验中，bFGF和TGF-β1分别修饰SD大鼠BMSCs均可促进其增殖。bFGF、TGF-β1双基因共同修饰SD大鼠BMSCs对其增殖有促进作用，但不具有协同作用。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：
实验各组24h后MTTOD值
pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 之间的差别有统计学意义（P＜0.01）；pcDNA3.1(+)-TGF-β1 组与 pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 之间的差别没有统计学意义（P＞0.05）。表十五 转染各组与对照组 24h MTT 光密度值（OD490）（ x ± s）组别 n OD 值bFGF*10 0.453±0.040a,b,cTGF-β1*10 0.395±0.048a,b,dbFGF+TGF-β1*10 0.396±0.016a,bpcDNA3.1(+) 10 0.324±0.023a空白对照组 10 0.267±0.009*bFGF =pcDNA3.1(+)-bFGF 组；TGF-β1 =pcDNA3.1(+)-TGF-β1 组；bFGF+TGF-β1 =pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 组。a=P＜0.01 VS 空白对照组；b=P＜0.01 VS pcDNA3.1(+)组；c=P＜0.01 VS pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1 组；d=P＞0.05 VS pcDNA3.1(+)-bFGF + pcDNA3.1(+)-TGF-β1组。
图 1A BMSCs 原代培养 3d(×100) 图 1B BMSCs 原代培养 5d(×100)图 1C BMSCs 原代培养 7d(×100) 图 1D BMSCs 传代培养 2d(×100)
【参考文献】
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本文编号：
2832084
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