色氨酸碳点的合成及其在细胞和细菌生物成像中的应用

发布时间：2020-10-08 21:33

　　 背景:生物学成像主要是对机体进行不同层次细胞、组织和分子水平的研究,它以能激发出荧光信号为基础。荧光成像已广泛应用于科学研究的许多领域,由于其具有反应灵敏度高、操作简单、价格低廉易得等优点已成为人们理解生命发展过程、细胞生理生态结构中一种必不可少的研究手段。选择适宜的造影剂对生物学成像来说是具有重要的参考价值。随着科学社会的快速发展,各种结构性能优异的荧光染色剂逐渐被发现并进行研究,从最开始的有机小分子荧光染料到荧光标记蛋白,再到半导体量子点、碳纳米材料等经过了一系列发展变化,随着探索的发展过程,荧光染料的功能结构也越来越好。有机小分子荧光染料的优点在于其对机体的干扰极小,缺点在于其使用时间过短利用率低,双色或者多色荧光不能同时标记,对生物体具有损伤作用主要是由于其光解后的产物所引起的,在使用过程中遇到强光也容易漂白,因此难以实现同时多色和无损伤的研究。半导体量子点比荧光染料可以承受多次光发射和激发、具有发射光谱窄和激发谱光宽等优势,缺点在于量子点中含有重金属离子,其对生物体和环境会造成很大的毒性。因此,如何开发和研制一种毒性小、能够多色成像的新型纳米材料将具有重要的意义。碳点作为一种可以激发出荧光的新型纳米材料,具有很高的抗漂白稳定性、吸收和发射谱宽而且可调、良好的生物安全性和低生物毒性,正是由于这些特点使其受到大批学者们的亲睐和探索兴趣。荧光碳点的低毒性和光稳定性,使其能够完全取代含有重金属的传统量子点,这些特性使碳点已成为最有希望的发光材料之一。有学者研究发现,荧光碳点可以呈现多色荧光当其在不同的激发波长状态下,主要是由于荧光碳点表面官能团中含有羟基,羟基对细胞壁的亲和力很高,加之碳点材料的尺寸小和穿透性强,能够很快吸附到细胞膜上,由于碳点材料具有多色荧光从而使细胞可以呈现不同颜色的荧光。且荧光碳点进入细菌后使细菌具有不同的荧光特性,以此来鉴别细菌。鉴于以上研究,本实验通过水热法制备色氨酸碳点,标记不同种类的成骨细胞、成纤维细胞和破骨细胞及不同种类的细菌,共聚焦下观察不同细胞和细菌的成像特征,为利用该碳点探讨不同细胞的生理形态和结构及鉴别不同种类的细菌具有重要的意义。方法:1.色氨酸碳点的制备采用经典的水热法(hydrothermal method),制备色氨酸碳点,并进行相关性能表征。2.色氨酸碳点的体外细胞毒性评价将MC3T3-E1(小鼠前成骨细胞系)、RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)、L929(小鼠成纤维细胞系)细胞分别在各自适宜的培养条件下培养在无菌96孔板,实验分为空白对照组,以及不同浓度色氨酸碳点溶液稀释液组(10μg.ml~(-1)、50μg.ml~(-1)、100μg.ml~(-1)、200μg.ml~(-1)、400μg.ml~(-1)、600μg.ml~(-1)),培养24h后,采用MTT比色法检测色氨酸碳点对三种细胞的各自细胞毒性。3.色氨酸碳点标记不同细胞的生物成像观察将本实验选择的处于对数生长期的三种细胞分别与最佳浓度的色氨酸碳点溶液共培养24h后,激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察色氨酸碳点对此三种不同细胞在不同激发波长下的成像结果。4.色氨酸碳点标记不同细菌的生物成像观察选择大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923),分别与不同浓度的色氨酸碳点溶液共培养24h后,通过结合曲线以测定最佳细菌成像的色氨酸碳点浓度和细菌浓度,应用荧光光谱仪测定不同种类细菌的光谱学特性,激光扫描共聚焦荧光显微镜观察不同细菌在色氨酸碳点受不同激发波长和荧光阈值条件下成像效果。结果:1.制备的色氨酸碳点水溶液外观呈深蓝色,大量稀释后呈无色。透射电子显微镜观察表明制备的色氨酸碳点为球形颗粒,粒径大小分布均匀,分散度较好,直径大小约为3.35nm;傅立叶红外光谱结果表明制备的色氨酸碳点保留了色氨酸中羧基、氨基等官能团,这些基团使碳点具有较好的分散性和水溶性。色氨酸碳点的光谱结果表明色氨酸碳点具有多对发射和激发光谱,可以表现激发依赖性。2.MTT检测结果色氨酸碳点的体外MTT结果显示当色氨酸碳点浓度为0μg.ml~(-1)、10μg.ml~(-1)、50μg.ml~(-1)、100μg.ml~(-1)、200μg.ml~(-1)组细胞毒性测试结果均为1级,均在正常生物安全范围内;色氨酸碳点浓度为400μg.ml~(-1)时随着浓度的不断增加,细胞逐渐呈现出低细胞毒性。3.细胞成像观察结果将RAW264.7、MC3T3-E1、L929三种细胞分别与色氨酸碳点共培养后,RAW264.7细胞呈椭圆形或圆形,细胞形态较小成团或成堆聚集。MC3T3-E1细胞体积较大可以是RAW264.7细胞的好几倍,细胞核大且形态圆整,整个细胞形态可呈梭形、锥形或者短梭形。L929细胞体积较大呈长梭形,具有突起。随着色氨酸碳点激发波长的改变,本实验选择的三种细胞在共聚焦荧光显微镜下观察均可以出现不同颜色的荧光。RAW264.7和L929细胞的细胞膜和细胞质为主要荧光聚集区域,而MC3T3-E1细胞则不同其整个细胞结构都具有荧光,细胞成像后荧光信号强度稳定且细胞大致轮廓清楚,说明色氨酸碳点的细胞成像效果好。4.细菌生物学成像观察结果4.1在体外不同细菌与色氨酸碳点溶液共培养后测定的最佳结合曲线时色氨酸碳点和细菌的浓度分别是400μg.ml~(-1)和1×10~8 CFU.ml~(-1)。4.2荧光光谱仪检测结果显示,在300nm~700nm激发波长下,色氨酸碳点标记金黄色葡萄球菌的荧光强度阈值比色氨酸碳点标记大肠杆菌的荧光强度阈值范围大。4.3不同细菌和色氨酸碳点在激光扫描共聚焦荧光显微镜下检测结果显示,在激发波长548nm下大肠杆菌成红色荧光图像、激发波长488nm时大肠杆菌成绿色荧光图像,金黄色葡萄球菌也可成绿色和红色荧光图像,但当设置荧光强度阈值高于色氨酸碳点标记大肠杆菌的荧光强度阈值范围且低于色氨酸碳点标记金黄色葡萄球的最大荧光强度阈值时,此时的荧光图像只能见到金黄色葡萄球菌,以此方法来鉴别大肠杆菌和金黄色链球菌。结论:1.应用水热法成功制备了色氨酸碳点,合成工艺操作简单易行;2.制备的色氨酸碳点荧光性能优异,生物安全性好;3.在体外细胞实验中,制备的色氨酸碳点能成功标记细胞,细胞形态完整且光学性能稳定,说明色氨酸碳点对细胞成像效果好4.体外细菌实验时,色氨酸碳点能够成功标记细菌且细菌形态良好,并且能够从形态学和荧光特性上检测和鉴定细菌,表明色氨酸碳点对细菌具有较好的生物学成像效果。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：

图 3.3 色氨酸碳点的 TEM 粒径分布图 图 3.4 色氨酸碳点的荧光光谱结果3.1.2 色氨酸碳点的荧光光谱结果如图 3.4 所示色氨酸碳点的荧光光谱图是以激发波长(nm)为横坐标, 荧光强度为纵坐标的曲线图， 其中 340nm、580nm、380nm、360nm、420nm、440nm

图 3.3 色氨酸碳点的 TEM 粒径分布图 图 3.4 色氨酸碳点的荧光光谱结果3.1.2 色氨酸碳点的荧光光谱结果如图 3.4 所示色氨酸碳点的荧光光谱图是以激发波长(nm)为横坐标, 荧光强度为纵坐标的曲线图， 其中 340nm、580nm、380nm、360nm、420nm、440nm

图 3.5 色氨酸碳点的 UV-vis 结果 图 3.6 色氨酸碳点的 FT-IR 结果3.1.3 色氨酸碳点的紫外可见吸收光谱结果色氨酸碳点的紫外可见吸收光谱是以发射波长（nm）为横坐标，吸光度纵坐标的曲线图（见图 3.5）。其是一条平滑的坡状曲线,由图 3.5 可见，色氨

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本文编号：2832783