转录因子Sox2在小鼠腭发育中的生物学功能

发布时间：2020-10-11 00:04

　　 研究目的:转录因子Sox2在胚胎干细胞的自我更新和全能性的维持中起着重要作用,并参与多种组织和器官的形成,而Sox2是否参与腭的发育及其机制并不清楚,本文的研究目的:(1)检测转录因子Sox2在小鼠腭发育过程中的时空表达特征;(2)以构建条件性Sox2基因敲除小鼠为实验研究模型,进一步研究和探讨Sox2在小鼠腭发育中的生物学功能。研究方法:(1)首先利用免疫组织化学技术(IHC),检测Sox2蛋白在小鼠腭不同发育时期的表达特征,并进行观察和分析;(2)然后构建Shh-cre,Sox2fl/fl识条件性敲除小鼠为研究模型,分别通过体视显微镜,扫描电镜(SEM),苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色),免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC),EdU 增殖标记,凋亡染色(TUNEL)以及实时荧光定量PCR(RT-PCR)等,探讨Sox2在腭发育中的生物学功能及分子机制。研究结果:(1)胚胎E11.5天至出生后PN0天,Sox2蛋白在口腔上皮,包括腭上皮和舌上皮中均有强烈的表达。腭突从上颌突中长出(E11.5天),并在口腔中沿着舌两侧垂直生长(E12.5-E13.5天),在腭前和腭后两个位置,Sox2在腭上皮、舌上皮中都有强烈的表达;随后(E14.5天),腭突上抬至舌背部,随着腭突在水平方向上的继续生长,Sox2在腭突前部的表达逐渐减少;两侧腭突相互接触、融合(E14.75天),最终中缝上皮消失(E15.5天),在腭中缝上皮中检测不到Sox2的表达,而在舌上皮中Sox2的表达始终存在。(2)Shh-cre,Sox2fl/fl条件性敲除小鼠与同窝出生的野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比较:Sox2基因在腭上皮中被部分敲除,在舌上皮中完全被敲除,表现为严重的继发腭腭裂,舌的形态异常并且与下颌骨黏连,在出生当天就死亡,但是,其正侧面观与野生型小鼠相比无明显差异。(3)E14.5-E15.5天,野生型(Sox2fl/fl)小鼠两侧腭突同时上抬至舌背部,并在水平方向上继续生长,接着与对侧腭突接触、融合;而Shh-cre，Sox2fl/fl条件性敲除小鼠表现为一侧腭突上抬,在水平方向上生长,但另一侧腭突不能上抬,继续在舌的一侧垂直生长。E14.5天时,EdU增殖标记实验表明,突变型(Shh-cre,Sox2fl/fl)小鼠上抬侧腭突与野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比较,无论是腭上皮还是间充质,细胞增殖能力未见明显差异;非上抬侧腭突与野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比较,腭上皮的细胞增殖能力下降,且差异具有统计学意义(P0.05),而腭间充质的细胞增殖能力无明显异常。TUNEL凋亡细胞染色实验显示,突变型(Shh-cre,Sox22fl/fl)小鼠的非上抬侧腭突和上抬侧腭突与野生型(Sox2fl/fl)小鼠相比较,均无明显差异。(4)RT-PCR结果:E14.5天时,在突变型小鼠的上抬侧腭突中,Fgf10、Shh、Fgf8、Pax9、Osr2等基因的表达量明显下调,但是Bmp4、Msx1的表达水平显著上调;在非上抬侧腭突中,Bmp4、Fgf10、Shh、Fgf8、Pax9、Osr2等基因的表达量明显下调,但是Msx1的表达呈显著上调趋势,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:(1)转录因子Sox2在小鼠腭发育过程中的表达模式具有时空特异性,提示Sox2可能参与小鼠的腭发育过程。(2)Shh-creSox2fl/fl条件性敲除小鼠出现严重的继发腭腭裂,提示Sox2基因在腭发育过程中具有重要生物学功能。(3)Shh-creSox2fl/fl条件性敲除小鼠出现腭裂的可能原因是:A.腭上皮细胞增殖能力下降B.舌发育异常(舌与下颌黏连)。(4)Shh-cre,Sox2fl/fl 条件性敲除小鼠腭发育相关基因表达水平的变化表明,无论是上抬侧还是非上抬侧腭突,腭发育相关基因均受到影响。
【学位单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R78
【部分图文】：

２．３．２?小鼠月咢形态观察结果??体视显微镜下，Ｅ１５．５天和ＰＮ０天，突变型小鼠和野生型小鼠的侧面观（图２－２?ａ－ｄ）、??正面观（图２－２ｅ－ｈ）均无明显差异；口内观（图２－２ｉ－ｌ，ｍ－ｑ），Ｅ１５．５天－ＰＮ０天时，野??生型小鼠原发聘与继发腭己经融合，形成完整的腭部，而５＾－ｃｒｅ，?５ｂｘ／Ｍ、鼠出现严重??的继发腭腭裂（图２－２ｊ，丨），并且舌头与下颌黏连在一起（图２－２ｍ?ｑ红色星号）。Ｅ１６．５??天时，矢状位切片ＨＥ染色结果显示，５ｂｘＷ小鼠出删ｆ裂（图２－２ｒ，?ｓ）并且??舌与下颌黏连（图２－２ｎ?ｓ红框）。扫描电镜结果显示，Ｅ１５．５天－ＰＮ０天，ＳｂｘＭ小鼠有??清晰并且对称的ｒｕｇａｅ?（图２－２?），而小鼠腭表面凹凸不平（图２－２ｕ，?ｖ??红框及黄框）。??３１??

滨州医学院硕士学位论文??２．３．３免疫组化验证＆ｘ２基因的敲除效率??Ｅ１４．７５天时，５ｂｘ２在小鼠腭上皮及舌上皮均有强烈的表达（图２－３ａ，ｄ，?ｈ，??ｋ），包括腭中缝上皮（图２－３ａ，ｈ）；然而在幼／７－ｃｒｅ，?Ｓｏｘｆ小鼠腭上皮中部分表达，在??舌上皮中完全不表达（图２－３?ｈ，ｋ）。??ｗｔ?＼?ｒ—ｙ?？？??＾?ｖ?．?ｉ?％??ｍｔ??ｈ?－＝?－－－?－??，ａ?ｉ??ｈ；囉議ｒ??图２－３?＆ｘ２在＆ｊｃ２＃小鼠中的表达??Ｆｉｇｎｒｅ２－３?Ｓｏｘ２?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｉｎ?Ｓｈｈ－ｃｒｅ，?Ｓｏｘ＾１１１?ｍｉｃｅ??Ｅ１４．７５天时，＊Ｓａｃ２在５＾，小鼠腭上皮和舌上皮中表达，而在猶－〇＾?Ｓａｖ＾小鼠腭上皮部分表达，在舌上皮中??检测不到Ｓａｒ２的表达。ｂ，ｃ，?ｉ，ｊ分别对应相应时期腭、舌上皮的局部放大。ｐ：腭；ｔ：舌；红框：腭上皮；蓝框：舌??上皮；ＷＴ：?ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ

学意义（Ｐ＜０．０５）；然而，间充质的细胞增殖率无明显变化（图２－５－３）。同时，突变型小??鼠上抬侧腭突与野生型小鼠相比较，无论是上皮细胞还是间充质细胞，增殖细胞的数量??在前后轴上均无显著差异（图２－５４）。??■Ｉ??１?ｍｕａｕ??■■■■??■■■■??？?■■■■??＾??＾?Ｉ?—??■■■■??图２－５－１?Ｅ１３．５天和Ｅ１４．５天，野生型小鼠和幼小鼠腭突细胞ＥｄＵ分析??Ｆｉｇｕｒｅ２－５－ｌ?Ｅｄｌｉ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?Ｅｌ?３．５?ａｎｄ?Ｅ１４．５?ｐａｌａｔａｌ?ｓｈｅｌｖｅｓ?ｉｎ?ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ?ａｎｄ?Ｓｈｈ－ｃｒｅ，?Ｓａｖ＾?ｍｉｃｅ??（ａ，?ｂ，?ｅ，ｆ）和（ｃ，?ｄ，ｇ，?ｈ）分别是野牛型小ＩＩ和突变型小鼠Ｅ丨３．５天和ＥＩ４．５天时，在聘前后轴ｌ?ｉＫＭ状位切??片，（ｉ－ｑ）足?ＤＡＰ丨染色，（ｉ’Ｋｉ’）足?ＥｄＵ?染色，（ｉ”＜）足前两者的合成。ＷＴ：?ｗｉｌｄｔ＞ｐｅ：?ＭＴ：?ｍｕｔａｎｔ，标尺：（ａ－ｈ｝２ｍｍ，??（ｉ－ｑ．?ｒ－ｉ＼＼?ｒ－ｑ＾）?２００＾ｎｉ??３５??
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本文编号：2835740