JQ1通过miR-191-3p抑制PTK6表达降低舌鳞癌细胞活性的相关研究

发布时间：2020-10-10 19:19

　　 口腔癌是全世界范围第六常见的恶性肿瘤,超过90%的口腔癌为口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC),近20年来,OSCC 的5年生存率没有显著提高,仍低于50%。诸多学者都认为,在分子生物学和分子病理学水平上研究OSCC的发病机制及抗肿瘤药物的作用机制能为OSCC的治疗提供新思路。近些年来,BRD4蛋白抑制剂作为一种较新的具有抗癌作用的药物进入人们视野。JQ1作为具有代表性的BRD4蛋白抑制剂,具有抑制OSCC细胞活性的作用,但关于其作用机制尚不明确。microRNA作为一种非编码小RNA,可以在分子水平上调控基因的表达。因此,为了探寻JQ1的抑癌机制,我们计划由miRNA入手,将JQ1处理前后的舌鳞癌细胞系Cal27细胞进行miRNA高通量测序分析,得出前后表达显著改变的mi-RNA及其靶基因,并进行进一步研究,主要包括以下方面。第一部分JQ1可以抑制Cal27细胞的活性目的:为检测实验采用的Cal27细胞对JQ1的敏感性如何,探究JQ1使用后多久发挥作用,确定适合进行进一步检测的时间,为后续实验做准备。方法:先将Cal27细胞接种于6孔板培育48h,分为三组,分别采用0μM、1μM、5μM的JQ1进行处理,在处理后第1、2、3、4天用CCK8检测肿瘤细胞的活性。再通过Western-blot评估BRD4的蛋白表达水平。结果:JQ1能抑制Cal27的细胞活性,当JQ1浓度为5μM时,第4天时细胞活性约为对照组的44.11%,差异显著(p0.01)。5μM的JQ1作用第4天时,其BRD4表达与对照组有显著性差异(p0.01)。结论:JQ1可以抑制Cal27细胞活性;我们选择使用被JQ1(5μM)作用4天的Cal27细胞作为后续送检的实验组。第二部分高通量测序检测筛选出miR-191-3p目的:探究在JQ1治疗Cal27细胞时,有哪些miRNA发生改变;其中改变最显著的有哪些;并预测其靶蛋白。方法:将Cal27细胞接种于培养皿中,实验组细胞使用5μM的JQ1处理,对照组不处理,培养4天后,提取总RNA。通过高通量技术HiSeq 2500(锐博)对两组RNA进行miRNA测序。通过TargetScan、miRTarBase、miRWalk预测目的miRNA的靶蛋白。结果:测序发现两组间多个基因表达有显著差异,其中miR-191-3p表达量log2(fold change)较对照组上调约8倍,变化最为显著(p0.01)。多个软件分析得出mir-191-3p的靶基因,选出其中与肿瘤相关的基因PTK6。结论:miR-191-3p表达改变最为显著,并选定靶蛋白PTK6进行研究。第三部分miR-191-3p上调引起Cal27细胞PTK6表达下降目的:验证miR-191-3p在鳞癌细胞系中对原癌基因PTK6有调控作用。方法:将Cal27细胞接种于6孔板培育48h,分为四组,使用转染的方式分别转染miR-191-3p的mimic、inhibitor、阴性对照及不做处理,用Western-blot检测48小时后各组细胞表达PTK6蛋白的量。再通过PCR评估PTK6的基因表达水平。结果:Western-blot结果显示:mimic组的PTK6蛋白表达量较inhibitor组明显偏低(p0.01);qRT-PCR进一步证实了这结果。结论:在Cal27细胞中,上调miR-191-3p会引起PTK6蛋白的表达下降。第四部分JQ1药物作用于Cal27引起PTK6下调目的:探究在Cal27细胞中加入JQ1是否会引起PTK6表达下降。方法:将Cal27细胞接种于培养皿培育,分为三组,分别为JQ1(1μM)、JQ1(5μM)加药组和对照组,处理后第4天提取蛋白,Western-blot检测两组PTK6蛋白表达情况。结果:Western-blot结果显示JQ1(1μM)和JQ1(5μM)加药组较对照组的PTK6蛋白表达量明显下降(p0.01,p0.001)。结论:JQ1可以使Ca127细胞中PTK6蛋白表达下降。经过以上研究,最终可以得出结论:JQ1能引起Cal27细胞内大量miRNA表达量发生改变,特别是通过上调miR-191-3p,可引起PTK6蛋白的表达下降;此外,JQ1可通过多种信号通路使细胞中PTK6蛋白表达下降,发挥抑制肿瘤生长作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.86
【部分图文】：

山东大学硕士学位论文??天时，ＪＱ１?５＾Ｍ组的ＢＲＤ４蛋白表达进一步降低。而ＪＱ１?ｌ＾Ｍ组较对照组的ＢＲＤ４??蛋白表达无显著差异（ｐ＞〇．〇５）。这证明了在高浓度ＪＱｌ?（５＾ｉＭ）的治疗下，Ｃａｌ２７??细胞的ＢＲＤ４表达会受到较明显的抑制，且在第３天ＪＱ１?５ｐＭ组的治疗效果就??已经较明显。??

?＾??ｆｏｌｄ?ｃｈａｎｇｅ（ｌｏｇ２）??图２－２?（Ａ）经高通量检测ＪＱｌ组与对照组表达量具有显著性差异（／？＜０．０１）的ｍｉＲＮＡ?（纵??轴），以及ＪＱ１组相对于对照组的表达量改变倍数的ｌ〇ｇ２指数（横轴）。（Ｂ）经高通量??检测ＪＱ１组与对照组表达量有显著性差异（ｐ＜０．０５）的ｍｉＲＮＡ?（纵轴）

图４－ｌ?（Ａ）采用购得的ｓｉＲＮＡ转染Ｃａｌ２７细胞系，分别为ｍｉＲ－１９１－３ｐ的ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ组组和ＮＣ组，于转染后７２ｈ检测各组ＰＴＫ６蛋白的表达水平以及（Ｂ）采用ＲＴ－ｑＰＣＲｍＲＮＡ转录水平。（Ｃ）在Ｃａｌ２７细胞中加入不含ｓｉＲＮＡ的转染试剂进行处理，作组，７２ｈ?检测?ＰＴＫ６?表达量，与?ｃｏｎｔｒｏｌ?组、ＮＣ?组进行比较。＊ｐ＜０．０５；?＊＊ｐ＜０．０１；?＊＊＊／？＜３．ＣＣＫ８结果??检测了?ｃｏｎｔｒｏｌ?组、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?组、ｍｉｍｉｃ?组、Ｍｏｃｋ?组和?ＮＣ?组在第?１２ｈ２ｄ、３ｄ的Ｃａｌ２７细胞的增殖能力，结果可见，ｍｉｍｉｃ组细胞增殖能力受到抑制，而其他四组均呈上升趋势。第三天ｍｉｍｉｃ组细胞增殖能力较ｉｎｈｉｂｉｔｏ著降低（／？＜〇．〇１），而较Ｍｏｃｋ组、ＮＣ组则也有降低，但差异不显著。组、ＮＣ组二者水平接近，无显著差异。ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ组细胞增殖能力高于其他与ｃｏｎｔｒｏ丨组接近。??３－２??２?０?ＮＣ??
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本文编号：2835478