牙周疾病作为人类口腔发生率较高的疾病之一,与龋病统称为人类两大口腔疾病。侵袭性牙周炎(aggressive periodontitis,AgP)是一类发病年龄早、病程进展快、破坏程度大、有家族聚集性的牙周疾病。AgP的发病因素多样,发病机制复杂。越来越多的证据表明,人类牙周疾病牙周支持组织的破坏过程中,结缔组织的降解和牙槽骨的破坏主要是通过诱导活化宿主细胞酶来实现的。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors of metalloroteinases-1, TIMP-1)在牙周疾病中的作用近年来引起众多学者的关注。该组蛋白水解酶主要通过对细胞外基质中大分子降解作用的调节,参与人体众多正常的生理过程和病理过程。MMPs与TIMP-1在正常的牙周组织中保持平衡,参与牙周组织的改建。而当在某些刺激因子或炎症的作用下,会引起MMPs发生过度分泌或其活性被激活,导致MMPs与TIMP-1的比例超出正常所在范围。研究表明MMPs及TIMPs的失衡可能是激活细胞外基质、基底膜细胞过度降解的重要原因,从而导致牙周软组织和牙槽骨组织胶原的破坏与丧失,进一步导致牙周疾病的发生 间质胶原酶(collagenases)是MMPs的第一大类,主要成员包括MMP-1、 MMP-8和MMP-13。其中MMP-1又被称为成纤维细胞型胶原酶(fibroblast collagenase, FIB-CL),主要来源于成纤维细胞、吞噬细胞和上皮细胞等,优先降解Ⅲ型胶原。有研究认为MMP-1是局限型侵袭性牙周炎中参与牙周组织破坏的胶原酶,尤其是对胶原降解的始动作用。MMP-8又被称为中性粒细胞型胶原酶(neutrophil collagenase, PMN-CL),是目前有关炎性牙周组织和龈沟液中MMPs表达研究中最多的一种,主要由多形核中性粒细胞产生和分泌,MMP-8主要参与Ⅰ型胶原纤维的破坏,而Ⅰ型纤维胶原又是牙周膜和牙槽骨组织的主要胶原组成成份。MMP-13是上皮组织中首要表达的胶原酶,且在多种牙周组织和细胞中表达,与组织中胶原纤维的快速转变密切相关,MMP-13对Ⅱ型胶原酶的活性较其他胶原酶更具影响力。TIMP-1是MMPs的内源性抑制因子,可以和大多数MMP结合,被认为是MMPs的重要内源性抑制因子之一。 近年来,大量研究表明胶原酶及TIMP-1水平及活性与慢性牙周炎关系密切,但有关胶原酶及TIMP-1水平在亚洲人群AgP患者中的研究尚未见报道。 目的： 本实验通过检测MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1在侵袭性牙周炎牙龈组织中的表达,与牙周临床指标相结合,了解MMPs及TIMP-1与AgP牙周炎症程度的相关关系,并将MMPs及TIMP-1比值作为新的指标进行分析,进一步分析MMPs及TIMP-1的平衡在AgP发展中的作用。 方法： 1.病例选择。实验组：选择来自广东省口腔医院牙周科和番禺分院牙周科就诊的30例侵袭性牙周炎患者(平均年龄29.37岁)。诊断标准依据1999年国际研讨会牙周病分类法提出的标准。对照组：选择来自广东省口腔医院外科就诊的因阻生齿、错位牙、埋伏牙而需要拔牙的20例牙周健康者(平均年龄26.35岁),所有患者无全身性疾病,6个月内未服用抗生素,未经任何牙周治疗等,并签署知情同意书。 2.样本采集。对纳入患者在其治疗前采用Florida探针进行全口牙齿的探查和记录。记录指标包括菌斑指数、探诊深度、出血指数、附着丧失,松动度以及根分叉病变,牙周炎患者拍摄全口根尖片。在符合侵袭性牙周炎标准不能保留牙齿拔除过程中获得牙龈标本,对照组在阻生牙等拔除术中采集牙龈标本。蒸馏水冲洗后,置于4%多聚甲醛中固定12～24h。 3.免疫组织化学检测。对固定样本行脱水,透明,石蜡包埋,制成3um的连续切片,采用多聚赖氨酸防脱片,60℃烤片2h。行MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1常规免疫组织化学方法检测。 4.对上述免疫组织化学结果进行定位及半定量分析。阳性细胞为细胞浆染色呈黄褐色的细胞。在x400倍光镜下,每张切片随机选择10个有阳性细胞表达的视野拍摄,IPP (Image Pro Plus)图片分析测量软件分析。根据得到的IOD (Integrated option density)值除以目标分布区域面积,得到MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1的平均光密度值,并计算MMP-1/TIMP-1、MMP-8/TIMP-1、 MMP-13/TIMP-1比值。 (5)统计学分析。采用SPSS13.0统计进行分析,计量资料结果用描述性分析结果,如x±s表示,各项指标经正态性及方差齐性检验后,对两组临床指标及TIMP-1、MMP-1、MMP-8、MMP-13表达情况及MMP-1/TIMP-1、 MMP-8/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1比值进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)或两独立样本非参数秩和检验。采用Spearman法进行相关分析,并绘制ROC曲线。检验水准均以a=0.05。 结果： 1. TIMP-1、MMP-1、MMP-8和MMP-13在牙龈组织中的表达和分布。①健康的牙龈组织中。TIMP-1在上皮层和固有层中均可观察到胞浆呈黄褐色的阳性细胞；主要分布区域是结缔组织区。MMP-1呈弱表达,在上皮细胞和固有层细胞中可见散在的阳性细胞,且在上皮层内的表达呈从棘细胞浅层到棘细胞深层染色强度递减趋势。MMP-8和MMP-13在上皮层和固有层中呈弱表达,主要分布区域为结缔组织区。②AgP组牙龈组织中。TIMP-1呈弱表达,主要表达部位在炎性结缔组织区；与牙龈健康组相比,差异无显著意义(P0.05)。MMP-1和MMP-8呈强阳性表达,上皮层和固有层中呈现大量密集的胞浆为黄褐色的阳性细胞,主要分布在固有层中炎性细胞密集区,与牙龈健康组相比,差异有显著性意义(P0.05)。MMP-13呈强阳性表达,上皮层和固有层中大量阳性细胞分布,主要表达部位在炎性细胞浸润区,与牙龈健康组相比,差异无显著性意义(P0.05)。 2.临床指标和实验指标间的相关关系。AgP组中MMPs及其与TIMP-1相应的比值与临床指标间存在着一定的相关关系。MMP-1、MMP-8、MMP-1/TIMP-1及MMP-8/TIMP-1与PD和AL均存在显著的相关关系(P0.05), MMP-1、 MMP-8、MMP-13、MMP-1/TIMP-1及MMP-8/TIMP-1与BOP存在显著的相关关系(P0.05)。说明MMPs与TIMPs及其比值与AgP的牙周炎症程度密切相关,随着炎症的加重,MMPs与TIMPs的失衡比也加大。各MMPs之间也存在一定的相关性：MMP-1与MMP-8、MMP-1与MMP-13及MMP-8与MMP-13之间存在显著的相关关系(P0.05),提示MMPs及TIMP-1的平衡可能在AgP发展中起有重要作用。 (3)把MMPs与TIMP-1的比值作为新因素进行分析。根据ROC曲线分析,AUC(MMP-8/TIMP-1)=0.947AUC(MMP-8)=0.752, AUC(MMP-1/TIMP-1)=0.870AUC(MMP-1)=0.835, MMPs与TIMP-1的比值的运用,可以大大提高ROC曲线下的面积值AUC,并依据ROC曲线标准,提示MMP-8/TIMP-1、 MMP-1/TIMP-1、MMP-1和MMP8指标可能是AgP牙周组织破坏和炎症程度的客观指标。 结论： 1. MMP-1、MMP-8、MMP-13三种胶原酶及TIMP-1可能参与了牙周组织的正常和病理改建过程。 2.本实验通过把MMP-1、MMP-8和MMP-13与TIMP-1的比值作为新因素来分析,发现其意义要远大于MMP-1、MMP-8和MMP-13单独作为影响因素来分析时的意义,为AgP病理机制的研究提供了新的角度和思路。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R781.42
【文章目录】：摘要
ABSTRACT
前言
材料与方法
1.研究对象的选择
2.全口牙周状况的检查和临床指标的记录
3.组织标本的制备
4.主要试剂
5.免疫组织化学步骤
6.结果判定
7.ImagePro Plus (IPP)计算机图像分析系统
8.统计学分析
结果
讨论
全文小结
参考文献
在读期间研究成果
综述
参考文献
致谢
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本文编号：
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