研究背景和目的口腔恶性肿瘤发病率约占全身恶性肿瘤发病率的5%,舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,其常在肿瘤早期即发生转移,且术后复发率较高,严重影响患者的治疗和预后。溴结构域蛋白4(bromodomain containing 4,BRD4)是溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extraterminal domain,BET)家族中研究最多的一个成员。它可以通过两个串联的溴结构域模块识别组蛋白H3和H4中的乙酰化赖氨酸残基,引起染色质重塑,进而调控细胞周期和DNA的复制、修复及转录。JQ1是BET家族的小分子抑制剂,其对BRD4的作用最强,可以竞争性的与BRD4中溴结构域结合,从而使BRD4蛋白和组蛋白中乙酰化的赖氨酸分离,进而干扰BRD4发挥其生物学作用[1]。目前,在多种肿瘤细胞中都已经发现JQ1可以作为BRD4的特异性抑制剂从而产生较为明确的抗癌作用。c-Myc是最早发现的原癌基因之一,是Myc家族中的重要成员,其可以与一些编码和非编码RNA的启动子调节区结合,行使其转录调节功能,从而促进细胞的增殖和分化。在许多恶性肿瘤中都可以看到c-Myc的高表达,其被认为与肿瘤的发生、发展和预后都密切相关。EMT是指上皮细胞在特定条件下转化成为具有间充质表型细胞的生物学过程,其被认为是肿瘤细胞获得迁徙和侵袭能力的关键。大量研究表明Twist基因是诱导肿瘤细胞发生上皮细胞-间充质转化(EMT)的主要参与者,其蛋白结构具有高度保守性,是碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族中的一员。随着Twist相关信号通路与恶性肿瘤关系研究的不断深入,其在肿瘤的诊断、治疗及预后评价的作用逐渐被人重视。本实验检测舌鳞状细胞癌中BRD4、c-Myc及Twist的表达,分析其与舌鳞状细胞癌发展、转移及预后的关系,并对其进行相关性研究;采用不同浓度的BRD4抑制剂JQ1对舌鳞癌细胞系进行处理,检测JQ1处理对舌鳞状细胞癌的增殖、侵袭、细胞周期及凋亡的影响;检测JQ1处理、BRD4过表达及干扰表达后对舌鳞癌细胞中c-Myc、Twist及EMT相关蛋白表达的影响。初步探讨BRD4在舌鳞状细胞癌发展及转移中的作用,并进一步了解BRD4抑制剂JQ1影响舌鳞状细胞癌的分子生物学机制,验证BRD4抑制剂用于舌鳞状细胞癌治疗的可行性,为开发安全有效的舌鳞状细胞癌新型靶向治疗方法提供思路。材料和方法1.BRD4在舌鳞状细胞癌中表达的研究使用免疫组织化学技术检测122例舌鳞状细胞癌组织标本中BRD4的表达,并对其进行统计学分析,分析其与舌鳞状细胞癌患者的性别、年龄、原发肿瘤范围、有无转移(淋巴结转移及远处转移)及病理学分级的关系。使用免疫荧光细胞化学技术检测舌鳞癌细胞系Cal27和HN6中BRD4的表达。2.BRD4抑制剂JQ1影响舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭、细胞周期及转移的研究使用CCK8技术检测不同浓度的JQ1对Cal27、HN6舌鳞癌细胞系增殖能力的影响;使用Transwell实验检测不同浓度的JQ1对Cal27、HN6细胞系侵袭能力的影响;使用流式细胞技术检测JQ1对Cal27、HN6细胞系细胞周期及细胞凋亡的影响,并使用Western blotting检测JQ1对Cal27、HN6细胞系细胞凋亡相关蛋白caspase-3表达的影响。3.BRD4抑制剂JQ1影响舌鳞状细胞癌发展和转移的分子机制研究实验一BRD4抑制剂JQ1通过影响癌基因c-Myc影响舌鳞状细胞癌的发展和转移使用免疫组织化学技术检测122例舌鳞状细胞癌组织标本中c-Myc的表达,分析其与舌鳞状细胞癌患者的性别、年龄、原发肿瘤范围、有无转移及病理学分级的关系;分析其与BRD4的相关性。通过转染Cal27细胞BRD4过表达质粒、shRNA,构建BRD4过表达及干扰表达Cal27细胞系。使用qRT-PCR技术检测不同浓度的BRD4蛋白抑制剂JQ1对舌鳞状细胞癌细胞系Cal27中c-Myc mRNA表达的影响,检测BRD4过表达及干扰表达Cal27细胞系中c-Myc mRNA表达变化;使用Western blotting技术检测不同浓度的BRD4蛋白抑制剂JQ1对舌鳞状细胞癌细胞系Cal27中c-Myc蛋白质表达的影响,检测BRD4过表达及干扰表达Cal27细胞系中c-Myc蛋白质表达变化。实验二BRD4抑制剂JQ1通过影响Twist促进上皮间充质转化影响舌鳞状细胞癌的发展和转移使用免疫组织化学技术检测122例舌鳞状细胞癌组织标本中Twist的表达,分析其与舌鳞状细胞癌患者的性别、年龄、原发肿瘤范围、有无转移及病理学分级的关系;分析其与BRD4的相关性。通过转染Cal27细胞BRD4过表达质粒、shRNA,构建BRD4过表达及干扰表达Cal27细胞系。使用qRT-PCR技术检测不同浓度的BRD4蛋白抑制剂JQ1对舌鳞状细胞癌细胞系Cal27中Twist、细胞间质标记基因Fibronectin、MMP9和上皮性标记基因E-cadherin的基因表达变化,检测BRD4过表达及干扰表达Cal27细胞系中Twist、Fibronectin、MMP9 和 E-cadherin 的基因表达变化;使用 Western blotting技术检测不同浓度的BRD4蛋白抑制剂JQ1对舌鳞状细胞癌细胞系Cal27中Twist蛋白质表达的影响,检测BRD4过表达及干扰表达Cal27细胞系中Twist、Fibronectin、MMP9 和 E-cadherin 蛋白质表达变化。结果1.BRD4在舌鳞状细胞癌中表达的研究免疫组织化学结果显示:122例舌鳞癌组织中,BRD4阳性表达为66例,其表达与性别和年龄不相关,而与肿瘤的原发肿瘤范围、有无转移和病理学分级相关。免疫荧光细胞化学显示BRD4在舌鳞癌细胞系Cal27和HN6中均呈阳性表达。2.BRD4抑制剂JQ1影响舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭、细胞周期及转移的研究(1)舌鳞癌细胞系Cal27、HN6中加入不同浓度的JQ1培养1天、2天、3天、4天、5天后,CCK8检测细胞增殖发现:与对照组相比,不同浓度的JQ1对肿瘤细胞均有抑制效果,且实验组的细胞增殖抑制效果随着药物浓度增加和作用时间延长而增强,呈现时间-剂量依赖性。(2)舌鳞癌细胞系Cal27、HN6中加入不同浓度的JQ1培养48h后,进行Transwell实验,结果显示:与对照组相比,不同浓度的JQ1对肿瘤细胞的侵袭能力均有抑制效果,且效果随药物浓度的增加而增强。(3)舌鳞癌细胞系Cal27、HN6中加入不同浓度的JQ1培养24 h后,进行流式细胞检测细胞周期,结果显示G1期的细胞比例增高,而S期的细胞比例降低。(4)舌鳞癌细胞系Cal27、HN6中加入JQ1(0.5μM)培养48h后,进行流式细胞检测细胞凋亡,结果示实验组细胞早期凋亡的比例较对照组增加。(5)舌鳞癌细胞系Cal27、HN6中加入不同浓度的JQ1培养24 h后,检测细胞凋亡相关蛋白caspase-3,结果显示实验组细胞caspase-3的表达较对照组增加,并且随药物浓度的增加caspase-3的表达也逐渐增加。3.BRD4抑制剂JQ1影响舌鳞状细胞癌发展和转移的分子机制研究实验一 BRD4抑制剂JQ1通过影响癌基因c-Myc影响舌鳞状细胞癌的发展和转移(l)免疫组织化学结果显示:122例舌鳞癌组织中,c-Myc阳性表达为87例,其表达与性别和年龄不相关,而与肿瘤的原发肿瘤范围、有无转移和病理学分级相关。统计学分析c-Myc的表达与BRD4的表达正相关。(2)与对照组(DMSO)相比,舌鳞癌细胞系Cal27与不同浓度JQ1共同培养24 h及48 h后,c-Myc的mRNA和蛋白质表达量均降低,且随药物的浓度的增加效果逐渐增强。(3)BRD4过表达Cal27细胞系中c-Myc基因表达量和蛋白表达量都升高。(4)BRD4干扰表达Cal27细胞系中c-Myc基因表达量和蛋白表达量都降低。实验二BRD4抑制剂JQ1通过影响Twist促进上皮间充质转化影响舌鳞状细胞癌的发展和转移(l)免疫组织化学结果显示:122例舌鳞癌组织中,Twist阳性表达为78例,其表达与患者的性别、年龄不相关,而与肿瘤的原发肿瘤范围、有无转移和病理学分级相关。统计学分析Twist的表达与BRD4的表达正相关。(2)与对照组(DMSO)相比,舌鳞癌细胞系Cal27与不同浓度JQ1共同培养24及48 h后,Twist的mRNA和蛋白质的表达量均降低,且随药物浓度的增加效果增强。(3)BRD4过表达Cal27细胞系中Twist基因表达量和蛋白表达量都升高。(4)BRD4干扰表达Cal27细胞系中Twist的基因表达量和蛋白表达量都降低。(5)JQ1处理后,Cal27细胞中细胞间质标记基因Fibronectin和MMP9表达下降,上皮性标记基因E-cadherin的表达上升。(6)BRD4过表达后Cal27细胞中细胞间质标记基因Fibronectin和MMP9表达上升,上皮性标记基因E-cadherin的表达下降。(7)BRD4干扰表达后Cal27细胞中细胞间质标记基因Fibronectin和MMP9表达下降,上皮性标记基因E-cadherin的表达上升。结论1.BRD4在舌鳞状细胞癌中高表达,其可能成为舌鳞状细胞癌治疗的靶点。2.BRD4抑制剂JQ1能够抑制舌鳞癌细胞的增殖、侵袭,促进其凋亡,且影响其细胞周期。3.BRD4抑制剂JQ1能够抑制舌鳞癌细胞系中癌基因c-Myc的表达,BRD4过表达使Cal27细胞中c-Myc表达上升。BRD4干扰表达使Cal27细胞中c-Myc表达下降。提示JQ1对舌鳞癌细胞增殖、侵袭、凋亡及细胞周期的影响可能是通过BRD4对c-Myc的表达影响介导的。4.BRD4抑制剂JQ1能够抑制舌鳞癌细胞系中Twist的表达,JQ1处理和BRD4干扰表达后Cal27细胞中Twist及细胞间质标记基因Fibronectin和MMP9表达下降,上皮性标记基因E-cadherin的表达上升。BRD4过表达后Cal27细胞中Twist及细胞间质标记基因Fibronectin和MMP9表达上升,上皮性标记基因E-cadherin的表达下降。提示BRD4通过影响Twist对EMT的调控可能是JQ1影响舌鳞癌细胞侵袭的重要途径。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.86
【部分图文】：
系Ｃａｌ２７和ＨＮ６为研究材料，通过免疫荧光细胞化学方法对其进行研究，研究??结果显示ＢＲＤ４在舌鱗癌细胞系Ｃａｌ２７和ＨＮ６中阳性高表达，并且ＢＲＤ４定位??于细胞核内，且在核仁中呈现明显的不表达（图１－２）。??２７??
麵??＾?．，?ｘ＜ｙｍ??图１－１?ＢＲＤ４免疫组织化学实验结果??（Ａ）正常舌粘膜组织；（Ｂ）舌鱗状细胞癌组织??Ｆｉｇｕｒｅｌ－１?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＢＲＤ４?ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｉｙ??（Ａ）?Ｎｏｒｍａｌ?ｔｏｎｇｕｅ?ｍｕｃｏｓａ；?（Ｂ）?Ｔｏｎｇｕｅ?ｓｑｕａｍｏｕｓ?ｃｅｌｌ?ｃａｒｃｉｎｏｍａ??为了进一步研究性别、年龄、原发肿瘤范围等因素与ＢＲＤ４蛋白表达相关性，??我们将样本进行分组，分别将舌鱗癌组织切片按照性别、年龄、原发肿瘤范围、??有无转移和病理学分级进行分组讨论。具体分组标准为：性别组以男女为分组标??准；年龄组取５５岁作为分界点，大于及等于５５岁为一组，小于５５岁为一组；??原发肿瘤范围以第八版ＵＩＣＣ肿瘤分期中舌癌的ＴＮＭ分期标准为依据，Ｔ１＋Ｔ２??为一组，Ｔ３＋Ｔ４为一组；有无转移组包括淋巴结转移及远处转移，所有患者至少??术后随访一年，并结合术后淋巴结清扫后病理报告，术后病理报告有淋巴结转移??及术后一年内出现淋巴结转移及远处转移者为一组，一年内未出现转移者为一组。??病理学分级参照世界卫生组织病理分化标准分为高中低分化
侵袭细胞数为（４０．２７±４．３２），０．５?ｐＭＪＱｌ处理４８ｈ后，侵袭细胞数为（３５．３２±３．６７），??ｌｐＭＪＱｌ处理４８ｈ后，侵袭细胞数为（２６．７８±３．１１），均低于对照组，具有统计??学差异（尸＜０．０５）（图２－２）。实验结果表明ＪＱ１处理可以降低Ｃａｌ２７和ＨＮ６细??胞的侵袭能力。??Ａ?Ｂ??ＤＭＳＯ?乂＇｜?’?Ｏ．ｌｎＭ?Ｈ?？〇??編麗、ｉ．?ｈ??１．＿誦＿?１１?Ｉ?Ｉ?Ｌ??ＤＭＳＯ?０?ＩｍＭ?０?５ｍＭ??ｃ?Ｄ??：麵於＿?ｒ°?Ｉ??．；■＊：．■?．?１?４０?？?Ｉ?＾??＇ＩＩＩ??崎也?ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??ｆ?？？?Ｐ?？ｙ：?？化５恤、？，？？？？?ｉ?Ｊ?ＤＭＳＯ?０?０．５ｆ？Ｍ?ＩｊｔＭ??图２－２?ＪＱｌ处理对Ｃａｌ２７和ＨＮ６细胞侵袭力的抑制作用??（Ａ）不同浓度ＪＱ１?（０?ｊｉＭ、０．１?ｎＭ、０．５?ｐＭ、１?ｊｉＭ）处理Ｃａｌ２７细胞系；（Ｂ）不同浓度??ＪＱｌ?（〇ｎＭ、０．１?ｎＭ、０．５ｎＭ、］?ｎＭ）处理Ｃａｌ２７细胞系后侵袭细胞数的统计分析；（Ｃ）??不同浓度ＪＱｌ?（ＯｇＭ、０．１?ｎＭ、０．５?｜ｉＭ、１?ｎＭ）处理ＨＮ６细胞系；（Ｄ）不同浓度ＪＱ１?（０??ＨＭ、Ｏ．ｌｆｉＭ、０．５ｎＭ、ｌｊｉＭ）处理ＨＮ６细胞系后侵袭细胞数的统计分析；统计分析时与??ＤＭＳＯ处理相比
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