同源异型盒基因与人涎腺腺样囊性癌发生、发展及诱导分化的研究

发布时间：2020-10-17 14:40

　　 目的： 涎腺腺样囊性癌是较为常见的涎腺恶性肿瘤之一，具有浸润性强，与周围组织界限不清，术后易复发；易侵入血管，沿血循环发生远处转移等特点。涎腺腺样囊性癌目前的治疗方法单一，缺乏理论研究基础，有必要从其发生发展的分子生物学基础上进行深入研究，同时探索新的有效的治疗方法。 同源异型盒基因家族(Homeobox gene family)是一个编码转录因子蛋白的基因大家族，其在生物特定的发育阶段及特定的组织中表达，编码一类特殊的转录调节因子，其表达产物不仅能调节所在细胞的分化，通过调节控制信息传递相关分子和多种激素的合成来影响相邻细胞间及远距离的信息传递，从而调节胚胎的发育和成熟，而且在成人组织细胞的增殖、分化过程中也发挥着主控作用。若同源异型盒基因中某DNA序列发生突变，就可能导致正常细胞表型变化而发生恶变，其异常表达，细胞将失去分裂增殖的控制，并且不能继续分化成熟，从而形成肿瘤。 涎腺腺样囊性癌的发生发展是多因素、多步骤的复杂过程，涉及多种基因的改变，并与转录因子的结构和功能及其之间的相互调节有关。同源异形盒基因作为转录因子中的一大家族，在肿瘤的发生发展过程中具有极其重要的作用。如果找出在涎腺腺样囊性癌发病中起作用的关键同源异型盒基因，将对涎腺腺样囊性癌发病机制的研究以及涎腺腺样囊性癌的临床治疗提供一个新的契机。本研究拟采用基因芯片筛选和人涎腺腺样囊性癌发病相关的同源异型盒基因，经荧光实时定量PCR技术(realtime-PCR)定量验证后，对标准化人涎腺腺样囊性癌细胞进行基因转染，检测癌细胞生物学性状是否改变，以期探索调控人涎腺腺样囊性癌发生、发展及诱导分化的关键基因，为发现其内在机制提供新思路，新证据。 方法： (1)设立6组人“涎腺腺样囊性癌／癌旁正常腺体组织”及2组“涎腺腺样囊性癌细胞／正常腺体组织”共8组样本。Trizol法抽提所有标本总RNA，纯化mRNA，用232种人类同源异型盒基因Oligo探针制成基因芯片；将等量的两组mRNA样本分别逆转录合成荧光标记的cDNA混合物探针，与上述基因芯片杂交，经严格洗片后，用扫描仪扫描芯片荧光信号图像，计算机软件数据处理，将所得的数据进行比较，找出其中具有共性的异常表达基因，以搜索出可能与涎腺腺样囊性癌发生、分化相关的Homeobox基因。 (2)选取了人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC—2、ACC—M作为实验组，人正常腺体组织作为对照组，提取总RNA，逆转录成cDNA。采用荧光实时定量PCR技术检测3条高度可疑的涎腺腺样囊性癌相关基因(TGIF、EVX1和PITX1)在不同样本中的mRNA表达水平，通过统计学分析找出明显异常表达的Homeobox基因。 (3)构建真核表达质粒pEGFP-EVX1，以EVX1为目的基因，采用阳离子脂质体介导质粒转染ACC-M细胞。实时定量PCR检测并通过NCBI的BLAST系统的Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)进行序列比对，对所得基因进行鉴定。转染细胞24h后进行荧光观察；同时进行细胞生长曲线的测定，MTT法检测细胞增殖并以细胞通过8μm孔径滤膜的能力来判断细胞的迁移能力。 结果 (1)6组组织样本的试验组出现上调的Homeobox基因67条，下调的Homeobox基因数量累计共54条；2组细胞样本中，出现上调的Homeobox基因12条，下调的Homeobox基因数量15条。同时出现在组织及2组细胞样本中的上调基因1条(TGIF)；下调基因7条(EVX1、IRX2、EN2、HOP、IPF1、MEIS2及PHOX2B)。 (2)PITX1在ACC-2、ACC-M与正常腺体组织中的表达均无差异，而TGIF、EVX1在ACC-2及正常腺体组织中的表达量无统计学差异；在ACC-M与正常腺体组织的表达量有统计学差异。 (3)将EVX1基因在ACC-M细胞中增强表达后，生长曲线和MTT法检测显示，细胞的增殖速度明显降低；转染后能通过8μm孔径滤膜的ACC-M细胞数明显减少，表明EVX1的表达增强，导致细胞迁移能力降低。 结论 (1)多种同源异型盒基因可能参与涎腺腺样囊性癌的发病过程。本实验筛选出3条高度可疑的涎腺腺样囊性癌相关基因(TGIF、EVX1和PITX1)。 (2)通过荧光实时定量PCR技术，进一步确定与人涎腺腺样囊性癌可能相关的同源异型盒基因为EVX1。 (3)EVX1基因可能通过调节细胞周期来抑制涎腺腺样囊性癌的生长和转移。
【学位单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

涎腺腺样囊性癌标本病理切片结果(300x)

ACC-2细胞培养3天b

图1.4巧例样本总RNA电泳图，可见清晰的285、185、55三条区带。.4EleetroPhoregramoftotalRNAexamPles(15sPeeimens):threezonesas28s，185and55eanclearlybeseen.表1.5各绍RNA抽提的结果Tablel.5TheresultsofRNAextraetlon组别XH3XH3一lXH4XH4一lXHSXHS一1XH7XH7一lXHgXHg一lXH10总量(ug)ODz6oZso琼脂糖电泳16228029228464225943】297342829合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格斗月Q肉了jjr，‘O八，白n︺7勺口‘，‘片件日八月月︶nU八UO八CO，八，O”O八11勺白勺白，‘l山勺1111
【参考文献】

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本文编号：2844923