人尿源性干细胞促进成牙骨质细胞增殖和成骨的初步研究

发布时间：2020-10-20 06:54

　　 目的:牙根吸收是正畸矫正过程中最常见的并发症之一,吸收严重者会发生牙齿的松动甚至脱落,牙根的吸收和修复主要由成牙骨质细胞调节,本实验将探讨人尿源性干细胞(hUSCs)对成牙骨质细胞增殖和成骨的影响,从而为临床应用hUSCs促进移动性牙根吸收修复提供一定的理论基础。实验分为两个部分。实验一:hUSCs对成牙骨质细胞(OCCM-30)生长及增殖的影响方法:1、应用高速离心法从人新鲜尿液中提取hUSCs,镜下观察其形态;2、流式细胞术检测其表面标志物,鉴定hUSCs;将hUSCs与OCCM-30按不同比例分为4组(G1:1:1,G2:2:1,G3:3:1及OCCM-30对照组),间接共培养两种细胞,共培养12h和24h后,镜下观察成牙骨质细胞的生长情况;3、共培养1d、3d和7d后,通过CCK8技术检测成牙骨质细胞的增殖情况。结果:1、hUSCs形态观察:从人新鲜尿液中成功提取h USCs,镜下观察发现,接种3-7d开始贴壁,7-10d开始集落状生长,10~14 d细胞数达50%~60%可传代,形态多呈米粒状,少数呈卵圆形或短梭形,经过传代至P3左右时细胞形态基本保持米粒状,培养至P8细胞开始凋亡;2、hUSCs的鉴定:流式细胞术检测hUSCs表面标志物,结果显示:CD29、CD73、CD90、CD146为阳性,CD34、CD133表达为阴性,具有间充质干细胞(MSCs)特性;3、镜下观察共培养后成牙骨质细胞生长情况:各组成牙骨质细胞均出现贴壁生长和增殖,其中G3组中成牙骨质细胞增殖速度最快为70%,覆盖率最高为100%。4、CCK8检测共培养后成牙骨质细胞增殖:OD值随着培养时间的增加而增加,各实验组的OD值均显著大于对照组(P0.05),G3组的OD值显著大于其他实验组(P0.05),将hUSCs和OCCM-30以3:1间接共培养后能显著促进成牙骨质细胞的增殖。实验二:hUSCs对成牙骨质细胞(OCCM-30)成骨的影响方法:实验分组和共培养方式同实验一,采用成骨诱导培养基对hUSCs和成牙骨质细胞进行定向成骨诱导;共培养7d后,进行碱性磷酸酶(ALP)染色;于3d、5d和7d后,进行ALP活性测定;共培养12d后,进行茜素红染色;共培养7d和12d后,实时荧光定量PCR(q-PCR)检测OPN、OCN的表达;结果:1、ALP染色:细胞质内呈现蓝色颗粒表示阳性,所有实验组细胞质内蓝色颗粒均显著多于对照组,各实验组间无差异。2、ALP活性检测:各组中ALP活性随着诱导时间的增加而增加,7天时活性最强,各实验组显著大于对照组(P0.05),G3组显著高于其他实验组(P0.05)。3、茜素红染色:实验组红染成骨钙化结晶分布多于对照组,G3组成骨钙化结晶分布最多。3、q-PCR结果显示:G3组中OPN、OCN的表达随着成骨诱导时间的增加而增加,其余组无明显变化;G3组中OPN、OCN的表达显著高于G1组、G2组和对照组(P0.05),G1组、G2组与对照组无显著差异(P0.05)。结论:hUSCs能显著促进成牙骨质细胞的增殖和成骨,为临床应用h USCs促进牙根吸收的修复提供了一定的理论基础。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R783.5
【部分图文】：

2）hUSCs 的准备：将生长密度约为 80%-90%P3 代 hUSCs 弃去原培养基，PBS冲洗 3 次，加入 0.25%胰酶 200μl 消化 2min，加入 hUSC 培养基终止消化后将细胞转移至 15ml 离心管内，离心（1000rpm／5min)后加入新鲜 hUSCs 培养基得细胞悬液。使用细胞计数板将浓度调整为 1×105/ml。3）hUSCs 与 OCCM-30 间接共培养：将 OCCM-30 以浓度为 1×105/ml 铺于悬挂式 24 孔板中，每孔 500μl，共同培养使用的培养基为 hUSCs 培养基。将 P3 代hUSCs 以不同比例转移至孔板内悬挂小室中（图 1）。hUSCs：OCCM-30 个数比为1:1 组为 G1，hUSCs：OCCM-30 个数比为 2:1 组为 G2，hUSCs：OCCM-30 个数比为 3:1 组为 G3。OCCM-30 单独成骨诱导为阴性对照组。于细胞培养箱内共同培养 12h、24h 后，移去孔板内所有 hUSCs 小室，镜下观察 OCCM-30 生长形态以及增殖情况，每组重复 3 次。

经 3-5d 后传代为 P3 开始密集生长（图 2C），7d 后传代为 P5，可见细胞多呈米粒样形态（图2D）。图 2:hUSCs 细胞形态（A.原代细胞；B.P1 代细胞；C.P3 代细胞；D.P5 代细胞）（×40）Fig.2：Morphology of hUSC（sA. Primary cell;B. The first passage;C. The third passage;D. Thefifth passage）（×40）

重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2 hUSCs 表面标志物的鉴定hUSCs 表面标志物的鉴定结果见图 3 和表 1。流式细胞术检测细胞表面标志物显示：CD29、CD73、CD90、CD146 为阳性, CD34、CD133 表达为阴性。CD29、CD73、CD90、CD146 为 MSCs 表面特异性标志物，而 CD34 是造血干细胞的表面特异性标志物，CD133 是造血干细胞和上皮细胞共同的特异性标志物，此结果说明 hUSCs 具有 MSCs 的类似表面标志物，属于 MSCs 的一类。
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本文编号：2848374