口腔癌中癌相关成纤维细胞体外生物学行为研究

发布时间：2020-10-28 04:37

　　 目的探讨人口腔牙龈鳞癌中癌相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts, CAFs)的体外增殖、黏附、侵袭、迁移能力,并研究其特殊相关蛋白表达,以口腔牙龈正常成纤维细胞(normal fibrolasts, NFs)作为对照;同时研究其体外异常侵袭、迁移能力与其细胞中成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein, FAP)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloprotease-2, MMP-2)表达水平的关系。 方法应用组织块贴壁法原代培养同一病人口腔牙龈CAFs及NFs;取三代以后纯化细胞进行形态观察,免疫组化染色、细胞增殖活性、贴壁率、划痕实验及transwell侵袭测试等,比较两种细胞的体外生物学行为差异;应用Matrigel凝胶包被过的transwell小室初步筛选非侵袭性细胞株CAFs-NI (carcinoma associated fibroblasts-non-invasive)及侵袭性细胞株CAFs-HI (carcinoma associated fibroblasts hyper -invasive),行免疫组化染色、Western Bloting免疫印记检测、流式细胞免疫荧光计数,分析其FAP、α-SMA、MMP-2三种蛋白表达水平差异。 结果 1纯化后的CAFs及NFs镜下呈现不同细胞形态及生长特性;两种细胞均表现为典型的‘S’形生长曲线,但是CAFs的体外增殖活性明显高于NFs;两种细胞各时间点贴壁率比较CAFs亦高于NFs;划痕实验表明,CAFs细胞运动能力更强,24h后可基本修复0.8mm的划痕,NFs迁移能力相对较低,CAFs的transwell侵袭能力也明显高于高于NFs (P0.05)。 2免疫组化染色鉴定发现,两种细胞均表现为波形蛋白(Vimentin)阳性表达及角蛋白(Cytokeratin)阴性表达,但是CAFs可有FAP、α-SMA及MMP-2的特异表达,而NFs则为阴性。 3免疫组化染色、Western Bloting免疫印记检测、流式细胞免疫荧光计数结果显示FAP、α-SMA及MMP-2三种蛋白在高侵袭性细胞株CAFs-HI中的表达水平均比CAFs-NI高(P0.05)。 结论 1口腔牙龈CAFs体外增殖、粘附、迁移、侵袭能力均高于NFs; 2口腔牙龈CAFs可特征性表达FAP、α-SMA及MMP-2等相关蛋白; 3口腔牙龈CAFs体外高侵袭能力与其FAP、MMP-2、α-SMA蛋白表达水平正相关,这三种蛋白可能介导CAFs某些特殊的生物学行为。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

2 结果2.1 细胞体外原代培养特点倒置相差显微镜下观察：4 天后，癌组织块边缘即有细逐渐形成晕圈包绕组织块，多数细胞梭形，间杂多边形细胞上皮细胞大量凋亡，成纤维细胞生长旺盛。癌组织培养 2 80%，见图 1-2，进行首次传代。正常组织首次传代在 3 周胞继续生长，上皮细胞逐渐凋亡，数量更少；此后成纤维速度更快，6-7 天可传一代；经 3 代后即全部纯化为成纤维下可见：NFs 呈树枝状，胞体舒展，胞浆丰富，胞质突多见胞大小一致，界限清楚，低密度时交织成网状，高密度时叠生长，见图 2-1。CAFs 大小形状不一，多为长梭形，胞细胞，高密度时排列紊乱，可重叠生长,接触抑制丧失，见

南京医科大学图 2 纯化的 CAFs 及 NFs 镜下形态。1 为 NFs 生长状态，2 为 CAFs 生长状态镜 ×100）2.2 免疫细胞化学染色结果纯化后的 CAFs 表现典型的间充值细胞特点 Vimentin 强阳Cytokeratin 阴性表达，与 NFs 相似，见图 3。但是与 NFs 相比，CAF达 α-SMA、MMP-2、FAP 蛋白，而 NFs 中此三种蛋白均为阴性表达的图片见图 4。详细的 CAFs 及 NFs 免疫细胞化学染色结果比较见表

FAP 阴性表达，3 为 CAFs 中 MMP-2 阳性表达，4 为 CAFs 中胞化学 ×200）表 1 CAFs 及 NFs 免疫细胞化学染色α-SMA MMP-2 FAP VimCAFs + + + + NFs - - - + 2.3 两种细胞增殖活性及生长曲线CAFs 及 NFs 均表现典型的‘S’形生长曲线，‘潜伏3-5 天为对数生长期。同样培养条件下，CAFs 增殖活性两种细胞生长曲线见图 5。
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本文编号：2859601