口腔鳞癌VEGF诱导DC免疫耐受型转化及其机制研究

发布时间：2020-11-02 10:08

　　 [研究目的]研究OSCC患者肿瘤组织及外周血中DC的IDO及PD-L1表达水平,并进行生存预后分析;研究OSCC患者肿瘤组织及外周血中VEGF的表达水平,分析其与tol-DC的相关性;初步探讨VEGF诱导tol-DC的相关分子机制。[研究方法]1、免疫荧光检测OSCC肿瘤组织冰冻切片中IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+双阳性细胞的存在。2、收集50例OSCC肿瘤组织,采用免疫组化双染检测OSCC患者肿瘤组织中tol-DC即IDO+CD1a+、PD-LI+CD1a+;免疫组化检测VEGF的表达情况,分析tol-DC与生存预后及临床病理学参数的相关性,以及与VEGF的相关性。3、采集25例OSCC患者及20例健康人外周血,流式细胞仪检测其Mo-DC、pDC的比例,及其表达PD-L1的情况,Elisa检测外周血血清中VEGF的含量,并分析其相关性。4、外周血中PBMC诱导为DC,iDC向mDC分化过程中,加入外源性VEGF因子刺激,观察DC表型的变化及其相关因子表达水平的变化。5、小鼠骨髓单核细胞诱导DC,分组:(1)iDC组;(2)mDC组;(3)VEGF组;(4)VEGFR1抑制剂组;(5)VEGFR2抑制剂组。采用Western blot检测各组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IDO、PD-L1的表达情况。[实验结果]1、免疫荧光结果显示OSCC组织中存在IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+,为后续实验提供基础。免疫组化双染结果示:IDO+CD1a+双阳性细胞在OSCC患者肿瘤组织中的数量明显高于正常组织(P0.05),为分析OSCC中IDO+CD1a+、PD-L1+CD1a+双阳细胞的数量对患者预后的意义,我们评估了 IDO+CD1a+、PD-L1+CDla+双阳性细胞与临床病理特征之间的相关性。在50例患者中,有21例高表达IDO+CDla+双阳性细胞,并且与肿瘤分期(P=0.0065)、淋巴结转移(P0.0001)、复发(P=0.029)、WPOI(P=0.044)有密切相关性。而在50例患者中,有19例高表达PD-Ll+CD1a+双阳性细胞,并且与淋巴结转移(P=0.0169)、复发(P=0.0147)、分化程度(P=0.0187)有密切相关性。我们的数据表明,表达IDO+CDla+、PD-L1+CDla+数量较高的患者存活率与OS和DFS相关,具有统计学差异。COX回归分析显示:IDO+CDla+(OS:P=0.029;DFS:P=0.036)、PD-L1+CDla+(OS:P=0.017;DFS:P=0.037)是OSCC中OS和DFS的独立危险因素,可作为OSCC的独立预后因素。VEGF在OSCC患者肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织(P0.05),发现VEGF的高表达与IDO+CD1a+及PD-L1+CD1a+的高表达密切相关,提示VEGF可能诱导tol-DC高表达IDO及PD-L1。2、流式检测OSCC患者外周血Mo-DC及pDC均较健康人下降,分析显示:OSCC患者Mo-DC及pDC的表达较健康对照者明显降低,这些数据表明OSCC微环境可能促使DC及其亚群减少。OSCC患者血清中VEGF的含量明显高于健康人,VEGF与Mo-DC的含量呈负相关(P0.05),然而,与pDC的含量呈负相关,但无统计学差异(P0.05)。OSCC患者中Mo-DC较健康人高表达IDO及PD-L1(P0.0001)。这些数据表明OSCC微环境可能促使Mo-DC的IDO、PD-L1分子表达水平升高,使DC向tol-DC转化。VEGF与Mo-DC表达的IDO、PD-L1均呈正相关(P0.05),证明在OSCC肿瘤微环境中VEGF可以促使Mo-DC向tol-DC分化,并高表达IDO、PD-L1。3、VEGF刺激后DC的聚集性变差,通过流式细胞仪检测:与mDC组相比,VEGF组表面的CD83、CD86、CD80、HLA-DR的表达明显下降(P0.05);VEGF组相较于mDC组分泌的PD-L1、IDO均有增多(P0.05)。这些结果说明VEGF因子可以抑制DC向成熟方向分化,可能使其分化为tol-DC。4、在加入VEGF刺激后,p-JAK2、p-STAT3、IDO、PD-L1蛋白的表达明显增多,在干扰了VEGFR1或VEGFR2后,p-JAK2、p-STAT3、IDO、PD-L1蛋白的表达下降,VEGF可以通过VEGFR1/VEGFR2激活JAK2/STAT3通路,诱导DC表达IDO、PD-L1增多。[结论]OSCC肿瘤组织及外周血肿瘤微环境中的VEGF与DC向tol-DC转化并高表达IDO及PD-L1密切相关,并且IDO+CD1a+和PD-L1+C1a+双阳性细胞可作为独立预后因素;细胞学实验表明:VEGF可以抑制DC的成熟,并促进其高表达IDO和PD-L1,从而诱导DC像tol-DC转化,初步探讨其机制,可能是因为激活了VEGFR1/VEGFR2-JAK2/STAT3通路,继而导致DC表达IDO、PD-L1增多,为进一步认识肿瘤免疫耐受的机制提供了新的实验依据和思路。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

ＧＢＩ－久红显色，在一张片子中显示出褐色和红色两种颜色。ＩＤＯ主要表达在胞??浆，免疫组化双染表现为粉红色，ＣＤｌａ主要表达在胞膜，免疫组化双染表现为??褐色。ＤＣ表达ＩＤＯ时，组化片表现为粉色及褐色，即为ＩＤＯ?ＣＤｌａ’（图２ｂ），??不表达ＩＤＯ时，组化片表现为褐色，即ＩＤＯ?ＣＤｌａ＋?（图２ａ）。评分方式：在高??倍镜视野下，随机选择５个区域，计数其中红色ＩＤＯ及褐色ＣＤｌａ共表达细胞??占只表达褐色ＣＤｌａ细胞的数目，一个区域内共表达细胞＞７５％为＋＋＋，５１％－７５％??为＋＋，１１％－５０％为＋，５１０％为阴性。统计学分析表明，ＩＤＣＴＣＤ丨ａ＊共表达细胞在??？ＳＣＣ患者肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织（Ｐ＜０．０５），为分析ＯＳＣＣ??中ＩＤＣＴＣＤｌａ—共表达细胞的表达对患者预后的意义，我们评估了?ＩＤＣＴＣＤｌａ？共??表达细胞与临床病理特征之间的相关性，见表丨，在５０例患者中，有２１例高表??达丨ＤＯ’ＣＤｌａ＋共表达细胞

OSCC组织中PD一LI奋CDla+

２．３．２?ＯＳＣＣ组织中ＶＥＧＦ的表达及其与ｔｏｌ－ＤＣ的相关性??通过免疫组化方法检测ＶＥＧＦ在ＯＳＣＣ组织中的表达情况，ＶＥＧＦ主要表达??在胞浆，免疫组化表现为褐色（图５）。ＶＥＧＦ的评分方式：在高倍镜视野下，??随机选择５个区域，每个区域随机计数细胞１００个，呈黄色至棕黄色颗粒为阳性??表达，计算出阳性表达的细胞所占的百分比，一个区域内着色细胞＞７５％为４分，??５１％＿７５％为３分，１１％－５０％为２分，＜１０％为１分，阴性为０分。根据细胞着色??评分：棕褐色－３分，棕黄色－２分，淡黄色－－１分，无着色或与背景一致的淡棕??色－０分。最后两者积分相乘：０－３为（－），４－６分为弱（＋）?，?７－９分较强（＋＋），??９－１２分为强（＋＋＋）。统计学分析表明，ＶＥＧＦ在ＯＳＣＣ患者肿瘤组织中的表达??水平明显高于正常组织（Ｐ＜０．０５）。然后，分析ＯＳ、ＤＦＳ和ＶＥＧＦ表达之间的??潜在关联
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本文编号：2866908