不同龋敏感儿童口腔变异链球菌不同基因型菌株葡糖基转移酶活性的实验研究

发布时间：2020-11-09 02:48

　　 目的：乳牙龋是儿童口腔中的常见病和多发病,而龋病的发生主要与变异链球菌有关。变异链球菌产生的葡糖基转移酶能利用蔗糖产生葡聚糖,在口腔细菌粘附和牙菌斑形成过程中起着非常重要的作用,被认为是致龋菌最主要的致龋因子之一。本课题在前期实验的基础上,从葡糖基转移酶活性方面,探讨不同龋敏感儿童口腔变异链球菌临床分离株不同基因型菌株在不同pH条件下的葡糖基转移酶活性的差异,分析其毒力因子在致龋过程中所起的作用,从而为完善乳牙龋危险性预测方法及乳牙龋的预防提供有力的理论和实验依据。方法：以前期实验获得的具有不同基因核型的高龋,龋失补指数(decayed,missing, filled teeth index, dmft)≥6、中龋,6dmft≥4,无龋,dmft=0共111株变异链球菌中选取66株(包括23种基因型)为实验菌株,于牛心脑浸液(Brain Heart Infusion, BHI)平板复苏,取典型菌落接种于胰蛋白酶水解物-酵母-L-半胱氨酸(Trypticase yeast L-cystine, TYC)培养基增菌24h,涂片检查为纯培养并生化鉴定后,配制相同浓度的(A540nm=1.0)各变异链球菌临床分离株菌悬液,按菌液与TYC液体培养基1：10(v/v)的比例接种细菌,加入不同pH值(以0.5为间隔,pH5.0-7.0)的含0.25%葡萄糖和0.05% Tween 80的TYC培养基中,37℃厌氧(80%N2,10%H2,10%C02)培养18h,将细菌培养物离心(3300 r/min)20min。在上清液中加入固体硫酸铵达60%饱和度,4℃冰箱放置过夜,离心(10000r/min)30min收集沉淀。将沉淀物溶于含0.01%NaNO3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.4),置入透析袋(分子量100000)中,于相同磷酸盐缓冲液透析48h,此即为粗酶制剂。粗酶制剂2.0ml加0.1ml 0.5mol/L磷酸盐缓冲液,0.1ml 0.5mol/L蔗糖缓冲液,0.4ml重蒸水37℃孵育1h,加0.24mol/L HCL终止反应。再加2.5ml重蒸水混匀,离心(2000 r/min)5min,以葡萄糖为标准,上清液中的还原糖用Neson-Somogyi法测定。以空白组调零,于波长620nm处读取吸光度值A。酶的活力单位定为标准条件下(37℃反应1h),每分钟从蔗糖释放1μmol/L还原糖所需的酶。结果：在pH中性条件下,高龋、中龋和无龋儿童口腔变异链球菌同一基因型菌株葡糖基转移酶活性存在差异：高龋组中龋组无龋组,且差异具有统计学意义(P0.05)；同一龋敏感儿童口腔变异链球菌不同基因型菌株葡糖基转移酶活性也有差异,其活性随基因型的增加而增加,但差异没有统计学意义(P0.05)。在pH5.0-7.0下,不同龋敏感儿童口腔变异链球菌不同基因型菌株葡糖基转移酶活性也存在差异：基因型越多的菌株葡糖基转移酶活性越高,但随着pH值的降低,酶活性逐渐越低；当pH5.5时,酶活性普遍降低,但源于高龋儿童携带基因型数目越多的菌株葡糖基转移酶仍具有较高活性。结论：中性条件下,不同龋敏感儿童口腔变异链球菌不同基因型临床分离菌株葡糖基转移酶活性是存在差异的,龋敏感性越高,葡糖基转移酶活性越高,即葡糖基转移酶的活性与变异链球菌的致龋力密切相关。不同龋敏感儿童口腔变异链球菌临床分离菌株葡糖基转移酶活性与培养条件有关,pH值越低,葡糖基转移酶活性越低。在不同pH条件下,携带基因型越多的菌株葡糖基转移酶活性越高,高龋儿童龋病的发生与变异链球菌的基因型有一定的相关性。
【学位单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R780.2
【部分图文】：

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变异链球菌菌株在BHI培养基中复苏48h后，表面粗糙，突起，边缘不齐ePhotoofStrePtoeoeeusmutansstrainsinB扭mehoursinanaerobieeondition.Morphologiealchaneter，roughsurface，Milkyandtobeembed，Proe革兰氏染色
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本文编号：2875764