牵张应力对MC3T3-E1和人牙周膜细胞成骨分化的影响及相关信号通路调控作用研究

发布时间：2020-11-09 05:39

　　 应力刺激是调节骨代谢、维持骨量和骨功能结构的重要因素之一。应力状态下的牙周组织改建是口腔正畸临床矫治的生物学基础，在机械应力刺激下，通过对牙周膜细胞以及成骨细胞生物学功能的调节，最终实现正畸牙齿的移动，同时维持牙槽骨组织应力改建的平衡。目前尽管人们对成骨细胞及牙周膜细胞的力学生物反应进行了大量的研究，包括其增殖、分化，功能状态、成骨或破骨相关细胞因子的表达，胞内信号转导通路等，但成骨细胞或牙周膜细胞对应力刺激的识别机制、信号转导机制、生物响应机制等还并不十分清楚，尤其是对其生物力学信号转导通路调节机制以及不同信号通路之间相互作用及相互关系知之甚少。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)信号通路和核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路是细胞内应力信号转导过程中两条重要的信号转导通路，在成骨前体细胞及牙周膜细胞成骨分化过程中发挥着重要作用。因此本研究通过MC3T3-E1成骨样细胞以及人牙周膜细胞的体外培养，通过建立细胞体外牵张应力加载模型，观察牵张应力对MC3T3-E1成骨样细胞或人牙周膜细胞成骨分化及相关基因表达的影响，了解牵张应力对ERK1/2与NF-kB信号通路的影响及两条通路之间的相互作用关系。 实验一：牵张应力对MC3T3-E1细胞成骨分化及相关基因表达的影响 本研究通过MC3T3-E1成骨样细胞体外培养，观察不同大小牵张应力刺激后，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、I型胶原（COLⅠ）、骨保护素(osteocalcin,OCN)、白细胞介素-6等基因表达的变化，研究发现，在8%及12%细胞形变率的周期性牵张应力作用下，MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及骨保护素(osteocalcin,OCN)基因的表达明显降低，而ALP是成骨细胞早期分化的标志， OCN是成骨细胞成熟的标志。结果表明，MC3T3-E1细胞在8%及12%细胞形变率的周期性牵张应力作用24小时后抑制了其向成熟的成骨细胞分化的能力。同时研究发现，牵张应力作用24小时后，I型胶原（COLⅠ）、白细胞介素-6（IL-6）基因表达显著增加。而COLⅠ是构成骨组织细胞外基质主要成分之一，说明早期的应力刺激可以促进骨组织细胞外基质的合成，是骨组织应力改建的物质基础。IL-6作为一种多功能细胞因子，参与了正畸牙齿移动过程中牙周组织的改建，并作为一种有效的破骨细胞活化因子，刺激破骨细胞的生成和骨吸收活动。 实验二：牵张应力介导ERK1/2与NF-kB信号通路对MC3T3-E1细胞成骨分化及相关基因表达的影响 通过分别给予ERK1/2信号通路和NF-kB信号通路的特异性抑制剂，在基因水平上了解牵张应力作用下ERK1/2信号通路和NF-kB信号通路对MC3T3-E1细胞成骨分化及相关基因表达的调控。本研究结果显示，在12%牵张应力作用下，MC3T3-E1细胞ALP、COLⅠ、IL-6的表达受ERK1/2信号通路的调控，而OCN基因表达的变化不受ERK1/2通路的影响。NF-kB信号通路抑制剂PDTH可显著抑制机械牵应张力作用下MC3T3-E1细胞ALP活性的降低，同时抑制IL-6基因的表达，而COLⅠ、OCN基因表达的变化不受NF-kB信号通路的影响。 实验三：牵张应力对MC3T3-E1细胞ERK1/2与NF-kB信号通路影响的研究 通过观察牵张应力对MC3T3-E1成骨样细胞应力信号转导通路ERK1/2与NF-kB通路本身信号分子的反应，研究牵张应力对MC3T3-E1细胞ERK1/2与NF-kB信号通路的影响及其相互作用关系。研究发现，当MC3T3-E1细胞受到12%细胞形变率的周期性牵张应力作用时，ERK1/2信号通路及NF-κB信号通路同时被激活，ERK1/2、IKK磷酸化水平显著提高，NF-kB（p65）表达明显增加，但阻断NF-κB信号通路并不会影响ERK1/2信号通路的激活。相反当阻断ERK1/2信号通路时NF-kB信号通路激活受抑制，说明ERK1/2位于IKK的上游，ERK1/2可能对IKK的磷酸化起作用。 实验四：牵张应力对人牙周膜细胞成骨相关基因表达的影响 通过利用人骨再生基因表达谱芯片及Realtime RT-PCR观察12％形变率牵张应力对人牙周膜细胞成骨相关基因表达的影响，探讨牵张应力对人牙周膜细胞成骨分化的影响。结果发现12%细胞形变率的周期性牵张应力抑制了其成骨分化能力，有21种相关基因表达明显升高，主要包括细胞外基质相关基因及与炎症活动相关细胞因子基因等。实验结果表明，牵张应力对牙周膜细胞生物学特性起着重要调控作用。在牵张应力作用下通过对牙周膜细胞分化、细胞因子、细胞外基质代谢的调节以适应牙周组织应力改建的平衡。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R783.5
【部分图文】：

征以及这些信号是如何转变为细胞内信号从而影响细胞的生物学了大量的研究。成骨细胞作为应力敏感细胞，在骨组织应力改建挥着重要作用，既是生物物理信号传递的传感器，又是应力刺激胞。但是，成骨细胞是如何识别应力刺激，并将机械应力信号转化学信息，启动细胞内的信号转导通路，从而把力学信号从胞膜核通过影响骨组织应力改建相关基因的转录和表达，最终发挥成定的生物学功能的，目前还并不完全清楚。成骨细胞应力环境下的机械因素产生于骨功能活动的载荷会导致骨骼的形变，骨皮质及髓腔内压和细胞间质液的流动，从而对成骨细胞产生牵张应力、压应力、及局部微环境电场的改变（如图 1 所示）。骨组织应力状态下的改类型、大小、应力频率、应力分布密切相关[1,2,3]。

高于这一数值发生骨重建，低于 50με 则发生骨με 的外力才能有效刺激骨形成。但是由于体内外应力环境织的生理性应力不足以引发体外培养的成骨细胞作出反应力的大小常以弹性膜的拉伸变形率表示。Kaspar 等[6]通过了 500με、1000με、3000με 力值范围内牵张力对成骨细胞三种应变状态下，细胞的数目均明显增加，骨钙蛋白的合aspar 等随后以 1000με 对成骨细胞连续加载 2d 发现，除 10％～48％外，I 型胶原的合成增加了 7％～49％，转ormins growth factor β，TGF-β)亦明显增加，而 ALP 的活性，骨钙蛋白的合成也减少了 5％～32％。因此认为适宜的骨细胞的生长分化，较大的力促进成骨细胞增殖的作用较张力对细胞的增殖和分化均有抑制作用。

博 士 学 位 论 文16图3. 成骨细胞机械应力感受器l细胞结构的张力完整性[15]细胞外基质、整合素、局部粘附蛋白和细胞骨架网络相互联系，彼此之间构成了一个完善的张力整合系统。细胞骨架的张力完整性影响细胞的形状及功能，是信息传递的重要环节。在应力的作用下细胞骨架的所有构件为了分散张力和压力而发生整体重排，从而导致细胞发生形变，细胞形状调节发出的调节信息以力的形式传递。因此，应力的变化可以通过细胞及其骨架内的力平衡而对细胞的生长和生化性质产生影响。当细胞受到来自体外的直接力学刺激时，它的形态和功能都会发生改变，由于张力完整性结构中存在预应力，若对该结构中的某一构件施加应力，所有相互连接的构件包括距离很远的构件就会整体重排。而细胞骨架重排可引起细胞形态的改变，通过与细胞膜上分子的直接联系，将力学刺激转化为生物化学信号在细胞内传递
【参考文献】

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1 李永明,林珠,唐林,张晓东;白介素-6与1,25(OH)_2维生素D_3联合作用下大鼠骨髓破骨细胞的体外诱导培养[J];口腔医学;2005年05期

2 唐丽灵,王远亮,潘君,卢晓,蔡绍皙;细胞结构的张力完整性[J];生物化学与生物物理进展;2001年02期

3 孙晓江;戴尅戎;汤亭亭;;流体剪切应力对骨细胞分子活动的影响[J];医用生物力学;2007年01期

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本文编号：2875974