靶向双重抑制TBK1和IKKi的新型化合物抗舌癌作用及机制研究

发布时间：2020-11-09 20:40

　　 目的： (1)探讨TBK1和IKKi在人舌癌细胞增殖中的作用,为靶向抑制TBK1和IKKi治疗舌癌奠定理论基础。 (2)验证新型化合物对TBK1和IKKi的抑制能力并评价其体外抗舌癌活性。 (3)阐释TBK1和IKKi双重抑制化合物对舌癌细胞诱导凋亡和抑制增殖的作用,及其相关机制。 (4)观察TBK1和IKKi双重抑制化合物在舌癌荷瘤裸鼠治疗效果,探讨其抑瘤作用及其发生机制,为其在舌癌治疗中的应用提供实验依据。 方法： (1)常规培养人舌癌细胞株SCC-9, SCC-15, SCC-25, Western blotting检测TBK1和IKKi及其磷酸化蛋白的表达情况,采用siRNA干扰技术分别抑制TBK1或/和IKKi后检测舌癌细胞增殖水平。 (2)检测LPS刺激下鼠单核巨噬细胞RAW264.7的IRF-3活化水平对化合物的TBK1和IKKi抑制能力进行评估,并采用MTT法测定化合物作用下的舌癌细胞株增殖水平。 (3)使用ApopTag原位凋亡检测试剂盒观察舌癌细胞在化合物200A作用下的凋亡现象,Western blotting对化合物200A诱导舌癌细胞凋亡相关蛋白进行分析,并探讨凋亡机制。 (4)建立SCC-9舌癌荷瘤裸鼠模型,应用TBK1和IKKi双重抑制化合物200A进行治疗,观察其对裸鼠肿瘤生长的影响及荷瘤裸鼠的毒性反应,采用免疫组化、Western blotting、RT-PCR分析化合物200A治疗前后肿瘤组织的VEGF, p-AKT表达。 结果： (1)三种舌癌细胞株中均可以检测到TBK1和IKKi及其磷酸化表达,p-IKKi的表达水平高于p-TBK1。siRNA干扰实验发现,与对照组比较,TBK1-siRNA, IKKi-siRNA SCC-25两组细胞的增殖水平略有下降,但无统计学意义(P0.05),但在SCC-25的TBK1和IKKi均被抑制后其增殖水平被显著抑制,与对照组相比具有统计学意义(P0.01)。 (2) Western blotting发现三种化合物均能下调LPS刺激下的RAW264.7细胞中IRF-3的磷酸化水平,其中200A作用相对较强。MTT法发现三种化合物对三种舌癌细胞株均具有较好的抑制作用(IC50介于0.430-1.901μM),其中200A在这三种舌癌细胞株中具有均衡的、较低的IC50,表现出较高的抗舌癌细胞增殖活性。 (3)形态学研究证实TBK1和IKKi双重抑制化合物可以促进舌癌细胞凋亡,随着化合物处理时间增长或化合物浓度增高,Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7及Cleaved PARP蛋白表达水平逐渐增高。舌癌细胞在TBK1和IKKi双重抑制化合物处理后,CyclinD1、p-AKT、p-CYLD蛋白表达水平下降。 (4)实验过程中随着200A腹腔注射时间增长,其对实验组裸鼠肿瘤生长的抑制效果逐渐加强(图5-1)。从第22天起,两组之间肿瘤体积差异具有统计学意义(P0.05),到第31天及之后,两组之间肿瘤体积差异具有更显著的统计学意义(P0.01)。治疗过程中,裸鼠精神状态佳,生长发育、饮食活动均未见明显异常,表明化合物200A毒性反应小。实验结束时实验组的肿瘤重量小于对照组,具有统计学意义(P0.05),瘤重抑制率为56.97%。免疫组化结果显示VEGF及p-AKT在实验组的阳性表达率明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.01),RT-PCR和Western blotting分别验证了该结果。 结论： (1)TBK1和IKKi在舌癌细胞中表达并活化,IKKi的磷酸化水平高于TBK1,同时抑制它们可有效抑制舌癌细胞的增殖,表明TBK1和IKKi可成为新型抗舌癌药物的分子靶点。 (2)TBK1和IKKi双重抑制化合物SR8185、200A和200B具有抑制TBK1和IKKi勺能力,且可抑制舌癌细胞增殖,尤以200A相对最佳,可作为新型抗舌癌药物的候选化合物。 (3)TBK1和IKKi双重抑制化合物具有抗舌癌作用,一方面细胞水平可呈时间和剂量依赖性诱导舌癌细胞凋亡、抑制其增殖,其机制可能与下调舌癌细胞Cyclin D1、p-AKT、p-CYLD的蛋白表达有关；另一方面机体水平抑制舌癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长,无明显毒、副作用,可能因为抑制AKT活化,下调VEGF表达,进而抑制肿瘤血管生成,发挥其抗肿瘤作用。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R739.86
【部分图文】：

三种舌癌细胞株SCC-9，SCC-15, SCC-25常规培养后提取蛋白，Westernblotting检测TBK1、p-TBKl、IKKi、p-IKKi的蛋白表达水平（图1-1)。结果显示TBK1和IKKi在舌癌的细胞中均有表达,IKKi的磷酸化水平比较高，但TBK1的憐酸化水平比较低，但亦可检测到，这三种舌癌细胞中IKKi的活化水平高于TBK1。雇國^ P-IKKi1I^HIHp"--mmr P -T B K 1P-actin士图1-1舌癌细胞中p-IKKi, IKKi, p-TBKl,TBKl的蛋白表达水平FigureI-1 Western blotting analysis of the expression of p-IKKi, IKKi, p-TBKl, TBKl inindicated cell lines.1.3.2人舌癌细胞SCC-25中siRNA抑制IKKi表达后对TBKl和p-TBKl的蛋白表达的影响采用siRNA技术抑制SCC-25细胞IKKi表达，发现IKKi表达沉默能明显上调TBK1与P-TBK1蛋白的表达（图1-2)。14

SCC-25细胞和对照组的IKKi, p-TBKl, TBK1的蛋ern blotting analysis of the expression of IKKi，p-TBKl,transfected with scrambled or IKKi-siRNA for 72 hSCC-25中siRNA抑制TBKI或/和IKKi之SCC-25采用siRNA抑制TBK1或/和IKKiKi-siRNA 及 TBKl&IKKi-siRNA SCC-25 四组3，5天进行细胞计数，数据见表]-1，绘制3天时，各组细胞增殖水平比较，差异无统计TBKl-siRNA, IKKi-siRNA SCC-25两组细胞，但他们三组之间差异并无统计学意义（P>纯抑制TBK1或IKKi时，其细胞増殖A SCC-25组细胞增殖水平低于其它三组，认为在SCC-25细胞中TBK1和IKKi均被抑

图1-3 SCC-25细胞转染图中所示的siRNA后的细胞增殖水平（J土?？，n=3 )(**/"<0.0丨差异具有统计学意义，siRNA干扰效率采用Western blotting验证）igure 1-3 Cell proliferation analysis of SCC-25 cells transfected with indicated siRNAs(X n=3)
【参考文献】

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1 张宇清,朱运松;干扰素调节因子-3的分子结构和磷酸化[J];生命的化学;2003年04期

本文编号：2876941