人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)为线状双链DNA病毒,是基因组最大的病毒之一,其感染在世界范围内广泛存在。我国是CMV感染的高发地区,2岁以下儿童往往就已经感染CMV,儿童血清抗体阳性率为83.2%-87.3%,成人血清CMV抗体阳性率则高达95%,但大多为无临床症状的隐性感染或机会性感染。CMV可以在体内长期潜伏,其潜伏部位主要在唾液腺、乳腺、肾脏等,当机体免疫功能低下时,病毒会被激活而导致多种疾病。CMV感染可导致多种口腔疾病,如涎腺炎、舍格伦综合症、牙周炎、复发性溃疡及腺体肿瘤等,严重影响人们的口腔健康。国内外学者已对CMV致病机制、预防和治疗措施进行了广泛而深入的研究,认识到细胞免疫在限制CMV传播和潜伏病毒激活中起主要作用,主要与CD8＋T淋巴细胞作用有关；另外,在CMV感染的急性期,机体受侵入病毒刺激亦产生相应的体液免疫,其中分泌型IgA作为外分泌液中的主要抗体类别,参与粘膜局部免疫,通过阻抑粘附、中和病毒等方式在局部抗CMV感染中发挥重要作用。 趋化性细胞因子是一个由分子量多为8-16kDa的多肽组成的,有20%-70%的氨基酸同源性的蛋白质家族,其与相应跨膜G蛋白受体相互作用,调节免疫细胞的迁移和活化,在天然免疫和获得性免疫中起重要作用。根据末端的半胱氨酸的位置、排列方式和数量,趋化性细胞因子被分为CXC、CC、C和CX3C四个亚家族。CCL28,又称粘膜相关上皮趋化因子(mucosae associated epithelia chemokine, MEC),是由Wang等人于2000年发现的一种在基因定位、蛋白质序列上有其独特性的CC家族趋化性细胞因子,由多种粘膜上皮组织细胞表达。CCL28受体为CCR10和CCR3,主要由CD4＋T细胞,CD8＋T细胞,IgA＋抗体分泌细胞(Antibody secreting cell, ASC)和嗜酸性粒细胞等表达,与配体CCL28和α4β1high/血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)相结合,在稳态运输中发挥重要作用。大量实验证实,CCL28具有抗微生物活性和粘膜富集特性,与粘膜其他抗微生物因素一起产生协同效应,构成了广谱的抗微生物保护层。更重要的是CCL28与其受体的结合,对IgA+ASC及CD8+淋巴细胞的游走、迁徙、归巢以及在免疫应答和免疫调节中起重要作用。 核转录因子NF-κB是一种多极性基因调控蛋白,由Rel蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体的形式存在。NF-κB系统由NF-κB家族及其抑制物IκB家族共同组成,几乎存在于所有细胞中。目前发现多种因素：病毒、细菌毒性产物LPS、双链RNA等；炎性细胞因子；物理化学因子；致凋亡因子等可诱导NF-κB活化,从而启动一系列靶基因的转录,参与调控多种重要免疫反应的细胞因子、炎症介质、粘附分子及蛋白酶类的表达,从而对免疫细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌功能起着直接的调控作用。因此,NF-κB在免疫系统中有着举足轻重的地位,是许多免疫过程相关基因转录调控的枢纽,通过影响免疫细胞内NF-κB的活性可直接或间接调控机体的免疫状态。 国内外大量实验证实,多种细胞因子或蛋白在体内的表达都是通过NF-κB途径来实现调节的,包括①细胞因子与生长因子,如IL-2、3、6、8、12、IL-1β、TNFα、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、EPO等；②免疫受体,如免疫球蛋白κ轻链、T细胞受体仪α、β链MHC-Ⅰ、Ⅱ、β2微球蛋白等；③粘附分子,如细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、内皮细胞白细胞间粘附分子等；④急性期蛋白,如血管紧张肽酶、补体因子C4、补体因子B等；⑤炎症酶,如诱导型一氧化氮合成酶、诱导型环加氧酶、胞质磷脂酶等。但至今未见关于NF-κB调节CCL28表达的相关体内实验报道。 目的： 本研究中,我们构建感染MCMV的BALB/c小鼠动物模型,证实感染成功后,取其颌下腺,检测感染MCMV后BALB/c小鼠颌下腺中CCL28在不同时间点的表达变化；然后应用PDTC抑制NF-κB途径,进一步观察BALB/c小鼠颌下腺中CCL28的表达变化,并探讨分析其与NF-κB信号转导的相关性,从而为进一步探索相关信号转导途径的具体机制奠定理论基础,以期为治疗CMV相关口腔疾病提供新的思路。 方法： 1.培养3T3细胞,传代第二天接种MCMV病毒,待80%-90%细胞发生细胞病变时,收集病毒,CPE法测定病毒滴度,参考文献注射剂量,用上述病毒感染BALB/c小鼠,ELISA法证实动物模型构建是否成功,HE染色观察唾液腺炎症浸润情况。 2.参考MCMV感染高峰期时间窗,分别于第7天和第15天处死正常组和MCMV感染组BALB/c小鼠,无菌分离出颌下腺,通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白水平检测感染MCMV后的BALB/c小鼠颌下腺中CCL28的表达变化。 3.BALB/c小鼠随机分为3组：a组为空白对照组,b组小鼠接种5×104PFU／只MCMV200μ1;c组接种MCMV病毒后,每天经腹腔注射PDTC抑制NF-κB转录因子的活化,7天后处死小鼠,无菌分离出颌下腺,分别检测CCL28的表达变化及NF-κB的活化程度,并探讨分析两者之间有无相关性。 结果： 1.3T3细胞感染MCMV后出现CPE,经测定MCMV病毒滴度为4.68×106TCID50, ELISA检测MCMV感染组小鼠100%抗MCMV-IgM阳性,说明小鼠100%感染MCMV,小鼠病毒模型构建成功。HE染色观察显示感染组小鼠唾液腺导管周围有单核细胞和淋巴细胞浸润,部分出现导管变性。 2.感染MCMV的BALB/c小鼠第7天时颌下腺中CCL28mRNA和蛋白表达量均较正常组显著升高；但第15天时颌下腺中CCL28mRNA和蛋白表达量较正常组稍有升高,无统计学意义；但较第7天感染组明显下降,P0.05,具有统计学意义。 3.Western blotting显示跟单纯MCMV感染组相比较,PDTC抑制组中NF-κB的活化程度明显降低,同时实时荧光定量PCR和Western blotting显示经PDTC抑制NF-κB活化后BALB/c小鼠颌下腺中CCL28的表达量均较单纯MCMV感染组明显降低。 结论： 1.感染MCMV的BALB/c小鼠病毒模型构建成功,病理切片证实BALB/c小鼠唾液腺有MCMV感染所致的典型病变。 2.BALB/c小鼠感染MCMV急性期时颌下腺中CCL28表达量明显升高,考虑是因为感染急性期小鼠体内MCMV大量复制,增强了影响CCL28mRNA合成的转录因子的诱导活化作用,从而使其颌下腺组织CCL28表达显著增高。随着CCL28表达增多,CCR10＋免疫细胞(CD4+/CD8+T细胞、IgA+ASC和嗜酸性粒细胞)迁徙归巢至感染颌下腺组织的数量增加,进而有利于局部免疫应答反应,控制MCMV感染进一步恶化使感染进入慢性期,从而使影响CCL28mRNA合成的转录因子的诱导活化作用较前减弱,故急性期过后CCL28的表达量降低,趋于正常水平。 3.PDTC抑制组BALB/c小鼠颌下腺中CCL28的表达量较单纯MCMV感染组明显降低,说明在PDTC有效抑制NF-κB的活化后,CCL28表达相应的降低,从而证明NF-κB的确对CCL28的表达起着一定的调控作用,即通过NF-κB途径可以实现对CCL28表达的正向调节,这就为探讨以CCL28趋化免疫细胞至粘膜相应部位发挥抗CMV感染作用提供了一条新的治疗思路。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R781.7
【文章目录】：目录
CONTENTS
中文摘要
ABSTRACT
前言
参考文献
第一部分 鼠巨细胞病毒感染BALB/c小鼠模型的建立
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第二部分 趋化性细胞因子CCL28在感染CMV涎腺中的表达变化
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第三部分 颌下腺中CCL28表达与NF-κB关系的初步探讨
材料和方法
结果
讨论
参考文献
全文结论
综述
参考文献
致谢
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