TERT-YAP介导的永生化牙周膜干细胞系的构建及其调控机制的研究

发布时间：2021-08-17 00:34

　　实验目的本实验旨研究Hippo/YAP信号通路介导人永生化人牙周膜干细胞系建立及机制。通过过表达TERT基因的慢病毒转染人牙周膜干细胞,建立永生化人牙周膜干细胞系。通过检测过表达TERT基因后的牙周膜干细胞Hippo/YAP信号通路中YAP/TAZ蛋白表达水平是否改变,并在此基础上加入YAP抑制剂维替泊芬,以此揭示Hippo/YAP信号通路介导人永生化人牙周膜干细胞系建立及作用机制,进一步深入认识永生化人牙周膜干细胞系建立的调控机制,为牙周膜干细胞用于牙周组织修复再生、治疗牙周疾病提供实验依据。实验方法1.使用酶消化组织块法分离获得原代人牙周膜干细胞;使用流式细胞术进行鉴定干细胞表面标志物的表达水平;检测所得细胞成骨、成脂及成软骨分化能力。2.过表达TERT基因的慢病毒转染人牙周膜干细胞;EdU染色法和CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术和Tunel染色法检测细胞凋亡;β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老;成骨诱导液矿化诱导检测成骨分化能力;裸鼠荷瘤实验检测细胞的成瘤性。3.Western Blot和实时荧光定量qRT-PCR检测增殖、凋亡、衰老及成骨基因的表达。使用维替泊芬抑制剂后再次检... 

【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－１?ｈＰＤＬＳＣｓ原代培养??

Ｈ??图ｌ－２ｈＰＤＬＳＣｓ?（Ｐ４）传代培养??２．?２ｈＰＤＬＳＣｓ干细胞表面标志检测??流式分析结果如图１－３。ｈＰＤＬＳＣｓ表达间充质干细胞特异性的阳性标志，包??括?ＣＤ９０?（９９．?７±０．?３０％）、ＣＤ４４（９９．?２±０．?１２％）、ＣＤ１０５?（９９．?２±０＿?１７％）、ＣＤ７３（９９．?８??±０．?２７％），低表达造血及上皮细胞特异性的阳性标志ＣＤ３４、ＣＤｌｌｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５、??ＨＬＡ－ＤＲ?（ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｃｋｔａｉｌ，?４．?３７±０＿?０３％）。（图?１－３）。??＇＊１?Ａ?Ａ?Ａ?＊?ＣＯＭ＜Ｏｉｉ？？ＣＤｌＳ＞ＣＯｔｉ＞？ｌ＞Ｏｆ＜??Ｍ７？?５?卜＂??．１?ｊ?ｖ?．Ｉ?，．?！?＼?ｉａ／?ｖ．?ｊ?ｖｙ?Ｉ?ｉ?＼ｉ?．?．?｜??，ｏ０?１？’?ｔｏ＊?，〇＊?？ｏ４?１０°?’〇?？〇＊?？〇Ｊ?ｔｏ４?１０＊?，。’?，ｏ７?１０’?Ｉ０４?１０°?１０＊?，０＊?１０＊?（〇４?ｔｐ１?，〇＊?ｔ〇４??ｈ？ｍ?＊ｉｉ?ｈ?ｎ．４Ｈ??图１－３ｈＰＤＬＳＣｓ?（Ｐ４）的干细胞表面标志检测??２．?３?ｈＰＤＬＳＣｓ多向分化检测??成骨诱导后茜素红染色结果显示有染为红色的矿化结节（图１－４，?Ａ）。成脂??诱导后油红〇染色结果显示有染为红色的脂滴（图１－３，?Ｂ）。成软骨诱导后Ａｌｃｉａｎ??ｂｌｕｅ染色结果显示蛋白聚糖沉积（图１－４

■ｍｉ?０Ｕ＿＿Ｕ＿Ｉ＿Ｉ＿＾Ｂ＿??图２－２ＴＥＲＴ－ｈＰＤＬＳＣｓ?ＴＥＲＴ基因表达情况??＊Ｐ＜０．?０５?＊＊Ｐ＜０．?０１??２．?３ＴＥＲＴ－ｈＰＤＬＳＣｓ干细胞表面标志物检测??流式分析结果如图２－３。ｈＰＤＬＳＣｓ表达间充质千细胞特异性阳性标志，包括??ＣＤ９０?（９９．?４±０．?２７％）、ＣＤ４４?（９８．?５±０．?２２％）、ＣＤ１０５?（９０．?４±０．?１５％）、ＣＤ７３?（９９．?１??土０．２３％），低表达造血及上皮细胞特异性阳性标志ＣＤ３４、ＣＤｌｌｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５??和?ＨＬＡ－ＤＲ?（ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｃｋｔａｉｌ，?０．４１５±０．?０３％）。（图?２－３）。??．?ｒ￣?！?Ｉ?ＣＯＭ＊Ｃ〇ｉ?０？??Ｊ?＇ｉ?Ｉ?＼?ｌ?＼?ｌｉ?ｉ?＇?ｉ＼?ｉ?Ｉ?！?＼ｌ?＼＼??．ＯＪ?ｉＵＵ?．ｕＡＪ?．ＬｉＪ?．ｌｉ＿Ｊ??１０？?ｔ〇’?１０＊?Ｍ＊?Ｉ＊４?１０?１０?１＃?１９?？〇?１８？?Ｉ＃＇?？０＊?ｉ？＊?？＃４?１０？?１〇＇?１０＊?１０＊?Ｍ＊?？０°?？？?ｉ〇＊?ｌ〇Ｊ?ｌ〇＊??ｎ．１?ｍ?ｒｕｎ?Ｈ４－？?＊ｉｉｍ??图２－３ＴＥＲＴ－ｈＰＤＬＳＣｓ干细胞表面标志物检测??２．?４转染后细胞生物学行为的改变??２．４．?１细胞增殖的改变??ＣＣＫ－８结果为：第３天时对照组０Ｄ值为１．０３土０．?１１５，实验组（０ＥＴＥＲＴＰ１??和?０Ｅ?ＴＥＲＴ?Ｐ３０）?０Ｄ值分别为?０．８７土０．２１１?与?０．８３±０．２０４?（／？＜０．０５）；第４天??时对照组０Ｄ值为０？?５２±０．?１０７


本文编号：3346700