染色体3p21.3区域中口腔鳞癌相关候选抑瘤基因的筛选及其功能的初步研究

发布时间：2021-10-30 09:47

　　口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤。尽管传统的手术、放疗、化疗及其综合治疗对早期OSCC可获得较好的治疗效果,但对于晚期或复发的病人难以达到满意的疗效。因此,研究OSCC发病的分子机制,寻找其早期诊断和治疗的分子标志物,将有助于发现新的治疗方法和提高口腔肿瘤病人的生存率和生存质量。越来越多的研究提示,恶性肿瘤实质上是一种基因疾病,其发生、发展涉及到多种基因的改变。抑瘤基因（tumor suppressor gene, TSG）在人体内往往发挥非常重要的生理功能,其失活、缺失与肿瘤的发生发展密切相关。许多抑瘤基因的发现都是通过研究等位基因杂合性丢失或纯合性丢失（loss of heterozygosity/homozygosity, LOH）而实现的。研究表明,染色体3p21.3区域在肺癌、鼻咽癌等多种肿瘤组织中表现为高频缺失,并存在多个与肿瘤发生密切相关的候选抑瘤基因。多个研究小组发现,该区域在OSCC中同样存在不同程度高频缺失（23%-50%）。目前,该区域内候选抑瘤基因在OSCC发生发展中的作用还鲜少有人研... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

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前言
技术路线图
第一章 3p21.3区候选抑瘤基因在口腔鳞状细胞癌中的筛选及其甲基化在基因表达中的作用
    第一节 材料和方法
        1 材料
            1.1 细胞和细胞系
            1.2 标本
            1.3 引物
                1.3.1 RT-PCR引物
                1.3.2 MSP引物
            1.4 菌株和载体
                1.4.1 菌株
                1.4.2 载体
            1.5 主要试剂/试剂盒
            1.6 主要仪器和设备
        2 方法
            2.1 组织和细胞总RNA的提取
                2.1.1 RNA的制备
                2.1.2 RNA中痕量DNA的去除
                2.1.3 总RNA的鉴定
            2.2 两步法差异RT-PCR
                2.2.1 逆转录反应
                2.2.2 PCR反应
                2.2.3 平台期循环数的确定
                2.2.4 灰度扫描与分析
            2.3 组织和细胞基因组DNA的提取
            2.4 MSPCR
                2.4.1 亚硫酸盐处理DNA
                2.4.2 MSP
                2.4.3 结果判定及分析
            2.5 PCR产物纯化测序
            2.6 甲基化产物测序
                2.6.1 制备感受态
                2.6.2 连接T载体
                2.6.3 质粒转化
                2.6.4 测序
            2.7 5-aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-CdR)处理舌癌细胞系
            2.8 统计学方法
    第二节 实验结果
        1 生物信息学分析确定待分析基因
        2 RNA质量检测
        3 基因扩增平台期的测定
        4 半定量RT-PCR检测候选基因的表达情况
        5 四个下调基因在TCA8113细胞和36对OSCC组织中的表达
        6 MSP分析基因在OSCC及其癌旁对照组织中甲基化情况
    第三节 分析与讨论
        1 染色体3p21.3区候选抑瘤基因在OSCC中的表达
        2 启动子区异常甲基化对基因表达的影响
第二章 LTF基因在舌癌中的生物学功能研究
    第一节 材料与方法
        1 材料
            1.1 细胞系
            1.2 标本
            1.3 菌株和载体
            1.4 引物
            1.5 主要试剂
            1.6 主要仪器
        2 方法
            2.1 组织和细胞总RNA的提取
            2.2 Real-time quantitative PCR(实时荧光定量PCR)
            2.3 免疫组化
            2.4 LTF/pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建
                2.4.1 质粒酶切、纯化和重组
                2.4.2 质粒转化
                2.4.3 LTF/pcDNA3.1真核表达载体的鉴定
            2.5 细胞转染
            2.6 建立稳定表达LTF基因的TCA8113舌癌细胞系
            2.7 培养细胞的蛋白质制备
            2.8 BCA法蛋白定量
            2.9 Western Blotting分析
            2.10 免疫细胞化学
            2.11 平板克隆形成实验
            2.12 噻唑蓝(MTT)比色实验检测细胞增殖能力
            2.13 流式细胞仪检测细胞周期
            2.14 统计学方法
    第二节 实验结果
        1 Real-time RT-PCR分析LTF的表达
        2 LTF蛋白在口腔鳞癌组织中的定位表达
        3 LTF基因mRNA水平以及蛋白水平表达分析的小结
        4 真核表达载体LTF/pcDNA3.1(-)的构建
            4.1 载体构建策略及流程
            4.2 pCMV6-XL5-LTF载体的鉴定
            4.3 真核表达载体LTF/pcDNA3.1(-)的构建
        5 建立稳定表达LTF基因的TCA8113细胞系
            5.1 细胞克隆的筛选
            5.2 RT-PCR分析稳定转染的细胞克隆中LTF基因mRNA水平的表达
            5.3 PCR鉴定稳定转染细胞中pcDNA3.1(-)载体的整合
            5.4 Western Blotting检测稳定转染后TCA8113细胞中LTF蛋白的表达
            5.5 免疫细胞化学检测LTF蛋白的表达及定位
        6 稳定转染LTF基因对舌癌细胞TCA8113细胞生物学特性的影响
            6.1 LTF基因对细胞增殖能力的影响
            6.2 平板克隆形成实验
            6.3 LTF基因对细胞周期的影响
    第三节 分析与讨论
结论
参考文献
综述
攻读学位期间主要研究成果(第一作者)
在读期间承担课题(第三责任人)
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA甲基化与膀胱癌研究进展[J]. 郭万松,杨波,丛宪玲,孔祥波.  中国实验诊断学. 2009(08)
[2]口腔鳞状细胞癌中凋亡蛋白酶活化因子甲基化的研究[J]. 李春艳,高文信,周延民,张茹慧,赵静辉,李秋实,李艳秋.  口腔医学研究. 2009(03)
[3]DNA甲基化与结肠癌[J]. 李新,罗鹏,刘莉.  国际消化病杂志. 2009(01)
[4]DNA甲基化与宫颈癌关系的研究进展[J]. 陈勇,陈双郧,冯景.  郧阳医学院学报. 2009(01)
[5]口腔癌的临床病理特征与预后[J]. 李江.  中国口腔颌面外科杂志. 2008(01)
[6]口腔粘膜癌前病变及鳞癌中RASSF1A基因甲基化与表达的研究[J]. 万扬,高文信,陈英新,崔玉波,刘永茂.  现代口腔医学杂志. 2007(01)
[7]鼻咽癌组织中GNAT1基因的表达、杂合性丢失及甲基化分析[J]. 易红梅,任彩萍,彭丹,周亮,李辉,姚开泰.  癌症. 2007(01)
[8]SEMA3B基因在鼻咽癌组织中的表达、杂合性丢失和甲基化分析[J]. 易红梅,任彩萍,彭丹,杨旭宇,赵明,姚开泰.  生命科学研究. 2006(02)
[9]DNA甲基化及其在肿瘤分子诊断中的前景[J]. 朱景德.  中华检验医学杂志. 2005(07)
[10]CDKN2A研究进展[J]. 阚卫兵,方肇勤,耿琳.  国外医学(肿瘤学分册). 2004(07)



本文编号：3466510