乳酸菌抑制变异链球菌生物膜形成的研究

发布时间：2017-05-20 11:11

  本文关键词：乳酸菌抑制变异链球菌生物膜形成的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：龋病是一种常见的细菌感染性口腔疾病,主要引起牙齿硬组织不同程度的破坏,不仅影响美观,还会造成牙根尖等部位的炎症,严重时可引发败血症或菌血症。变异链球菌(Streptococcus mutans)是目前公认的主要致龋菌,该菌不仅具有较强的产酸耐酸性,而且能够利用蔗糖产生不溶性胞外多糖,进而促进大量菌群在牙齿表面聚集,形成牙菌斑生物膜,导致龋齿。鉴于龋病的发生与口腔菌群失调密切相关,利用益生菌疗法来调整口腔菌群生态平衡可能是预防龋病的有效途径。本文通过体外生物膜模型探究乳酸菌抑制变异链球菌生物膜形成能力与其本身性质的关系,并筛选具有预防龋病潜力的益生菌,进而研究其口腔益生特性以及安全性,为益生菌在龋病预防中的应用提供依据。为了探究乳酸菌的抑菌性与抑制变异链球菌生物膜形成之间有无相关性,首先以传统发酵食品,健康成人的粪便、唾液、酸奶等为筛选源,获得97株乳酸菌。通过牛津杯琼脂扩散实验,考察乳酸菌对S.mutans的抑菌情况。发现这些乳酸菌对S.mutans抑菌情况有明显差异,抑菌圈大小在0~25 mm范围内变化。然后根据体外抑菌效果的差异,随机选取了16株乳酸菌来研究其对S.mutans生物膜形成的影响,结果显示这些乳酸菌抑制S.mutans生物膜形成的效果差异较大,但是与乳酸菌的抑菌性之间并没有相关性。为了进一步探究乳酸菌的菌体性质与抑制效果之间的相关性,选取了抑制S.mutans生物膜形成效果有差异的10株乳酸菌,测定了它们的自聚能力、自身生物膜形成能力、与浮游的变异链球菌的共聚能力、表面疏水性和表面酸碱电荷。结果表明乳酸菌自身生物膜形成能力与抑制效果间呈明显的负相关,而自聚能力和共聚能力与抑制效果的关系受自身生物膜形成能力的影响,表面疏水性与抑制效果无规律性,表面较低的酸电荷和较高的碱电荷有助于发挥抑制作用。一株来源于浸泡苋菜梗卤汁的乳酸菌RS4对S.mutans生物膜形成的抑制率高达88.72%。此外,该菌株在2 h时的自凝集率和与浮游的S.mutans的交互凝集率分别为14.55%和11.57%,自身生物膜形成量为0.21(OD600),疏水作用力为67.1%,表面酸电荷和碱电荷分别为16.74%和67.62%。与其它菌株相比,RS4具有较高的自聚能力、与浮游的S.mutans共聚能力、疏水作用力和酸碱电荷以及较低的生物膜形成能力,这些性质有助于RS4在口腔中快速生存和繁殖,阻止浮游的S.mutans对牙面的粘附并将其从口腔中清除,并且该菌在牙面形成生物膜能力低,因此有潜力成为预防龋病的益生菌。该菌经16S r DNA鉴定后命名为韩国魏斯氏菌Weissella koreensis RS4。为了进一步探究RS4对S.mutans生物膜形成的影响,首先考察了RS4对不同时期S.mutans生物膜形成的影响。在变异链球菌粘附初期(0 h)、定植初期(6 h)、生物膜开始形成初期(12 h),生物膜基本结构形成(24 h)或成熟生物膜形成后(48 h)加入RS4进行干预时,生物膜形成量的抑制率分别为84.23%、70.72%、87.65%、40.98%、65.72%,生物膜中细菌总面积的抑制率分别为88.26%、89.17%、90.46%、43.94%、78.08%,生物膜活性分别为22.72%、29.59%、34.18%、19.79%、31.43%。无论在何种时期作用,RS4均可以抑制或者破环生物膜典型结构,使菌体在生物膜中呈零散状分布。随后我们评估了RS4的作用对S.mutans生物膜中胞外多糖的生物量及结构的影响。结果发现,胞外多糖的分布与菌体的分布在生物量及结构上均相一致,对生物膜形成起着关键性作用的不溶性胞外多糖的含量也随着生物膜中菌体量的减少而降低。对RS4产糖能力的测定发现RS4产胞外多糖的能力很高,达到106.65±0.69 mg/m L。上述结果说明RS4不仅没有促进S.mutans生物膜中胞外多糖的量,反而有降低的趋势,从而避免了大量菌体的粘附与聚集。为了评估RS4在口腔中的应用特性,我们对RS4的粘附能力、生物膜形成能力以及与口腔应用相关的性质进行了测定。结果发现RS4对唾液包被的羟基磷灰石的粘附能力较低,为30.72%,显著低于S.mutans的64.22%;可以通过竞争、替代和排阻作用不同程度地抑制S.mutans对唾液包被的羟基磷灰石的粘附,抑制率分别为40.45%、24.67%和14.33%;在不同蔗糖浓度下自身形成生物膜的能力均较低,低p H和Ca2+的存在有助于提高它与浮游的S.mutans的共聚能力,并可耐受0.8 mg/m L溶菌酶,有望作为口腔益生菌来预防龋病。此外使用RS4模拟日常口腔清洁过程,结果发现RS4处理组生物膜中的菌体明显呈零散状分布,菌体密度较小,说明其对S.mutans生物膜的形成有较强的抑制作用。因此RS4有望成为预防龋病的益生菌,并可用于进一步研究。
【关键词】：乳酸菌 变异链球菌 抑制 生物膜 预防龋病
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.1;TS201.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 绪论10-17
• 1.1 龋病10-11
• 1.1.1 牙菌斑生物膜与龋病10
• 1.1.2 变异链球菌与牙菌斑生物膜10-11
• 1.1.3 预防和控制龋病的措施11
• 1.2 益生菌干预病原菌感染的作用机制11-13
• 1.2.1 产生抑菌物质12
• 1.2.2 免疫调节12
• 1.2.3 黏附机制12-13
• 1.3 益生菌抑制变异链球菌的研究进展13-15
• 1.3.1 益生菌对变异链球菌的杀菌效果13
• 1.3.2 益生菌与浮游的变异链球菌的共聚13-14
• 1.3.3 益生菌对变异链球菌生物膜的影响14-15
• 1.3.4 益生菌在口腔中的定植15
• 1.4 立题背景和意义15-16
• 1.5 本课题研究的主要内容16-17
• 2 材料与方法17-25
• 2.1 实验材料与试剂17
• 2.1.1 实验菌株17
• 2.1.2 培养基及试剂17
• 2.2 主要仪器与设备17-18
• 2.3 实验方法18-24
• 2.3.1 乳酸菌的分离与纯化18
• 2.3.2 乳酸菌对变异链球菌的抑菌性实验18
• 2.3.3 乳酸菌对变异链球菌生物膜形成的影响18-19
• 2.3.4 乳酸菌菌体性质与抑制效果关系的分析19-20
• 2.3.5 乳酸菌 16S rDNA的克隆与鉴定20
• 2.3.6 乳酸菌对不同时期变异链球菌生物膜形成的影响20-22
• 2.3.7 乳酸菌与口腔应用有关性质的研究22-24
• 2.4 统计学分析24-25
• 3 结果与讨论25-46
• 3.1 乳酸菌对变异链球菌的抑菌性分析25-27
• 3.2 乳酸菌的抑菌性与抑制变异链球菌生物膜间相关性分析27-28
• 3.3 乳酸菌的菌体性质与抑制变异链球菌生物膜间相关性分析28-32
• 3.3.1 乳酸菌的自聚集能力与抑制效果关系的分析28-29
• 3.3.2 乳酸菌自身生物膜形成能力与抑制效果关系的分析29-30
• 3.3.3 乳酸菌和浮游的变异链球菌的共聚能力与抑制效果关系的分析30
• 3.3.4 乳酸菌的表面性质与抑制效果关系的分析30-32
• 3.4 韩国魏斯氏菌RS4 对变异链球菌不同时期生物膜形成的影响32-41
• 3.4.1 对变异链球菌生物膜形成量的影响33
• 3.4.2 对变异链球菌生物膜结构的影响33-36
• 3.4.3 韩国魏斯氏菌RS4 产胞外多糖能力的分析36-37
• 3.4.4 对变异链球菌生物膜中胞外多糖分布的影响37-41
• 3.5 韩国魏斯氏菌RS4 口腔应用方面的评价41-46
• 3.5.1 韩国魏斯氏菌RS4 对唾液包被的羟基磷灰石的粘附能力41
• 3.5.2 韩国魏斯氏菌RS4 对变异链球菌粘附羟基磷灰石的影响41-42
• 3.5.3 韩国魏斯氏菌RS4 在不同蔗糖浓度下形成生物膜的能力42
• 3.5.4 不同因素对韩国魏斯氏菌RS4 与浮游的变异链球菌共聚的影响42-44
• 3.5.5 韩国魏斯氏菌RS4 对溶菌酶的耐受能力44
• 3.5.6 韩国魏斯氏菌RS4 对变异链球菌生物膜长期作用的影响44-46
• 主要结论与展望46-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-55
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨颖;陈卫;田丰伟;张灏;汤坚;;产抑菌物质乳杆菌的筛选及性质的研究[J];工业微生物;2006年03期

  本文关键词：乳酸菌抑制变异链球菌生物膜形成的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：381442