IGF-1通过JAK-STAT通路促进牙髓细胞增殖和分化的体外研究

发布时间：2017-06-04 18:24

  本文关键词：IGF-1通过JAK-STAT通路促进牙髓细胞增殖和分化的体外研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过观察JAK-STAT通路抑制剂AG490对IGF-1调控人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)增殖、矿化能力及矿化相关基因的影响,探讨JAK-STAT通路在IGF-1促牙髓细胞增殖和分化中的作用。方法:牙髓细胞分离培养及来源鉴定:选取因阻生或者正畸减数拔除的健康恒牙,采用组织块酶消化法分离、提取牙髓细胞并进行原代培养,当细胞增殖并汇合达孔底80%时,用0.25%胰蛋白酶消化并传代,牙髓细胞传至3~4代时,选用免疫组化法检测波形蛋白和角蛋白表达以鉴定细胞来源。IGF-1对人牙髓细胞增殖的影响:以3×103个/孔牙髓细胞接种于96孔培养板中,细胞培养24h后,换无血清DMEM饥饿细胞24h,然后分别用含2%血清浓度的5、10、25、50和100ng/ml IGF-1刺激液继续培养,培养1d、3d、5d和7d,每3天换一次液,每孔加20μl MTT溶液,4h后吸净培养液,每孔加150μl DMSO溶液,酶标仪以490nm波长检测各孔吸光度(OD)值。IGF-1诱导牙髓细胞增殖过程中JAK-STAT通路的作用:以同样实验条件将牙髓细胞接种于96孔板中,分5组:①对照组②空白对照组③100ng/ml IGF-1组④50μmol/L AG490+100ng/ml IGF-1组⑤50μmol/L AG490组,培养1d、3d、5d和7d采用MTT法检测细胞增殖。碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析IGF-1对人牙髓细胞的矿化作用:以2×105个/孔牙髓细胞接种于6孔板中,待牙髓细胞融合至80%时,换成以下4组矿化诱导液①矿化诱导液(Control/M)②100ng/ml IGF-1的矿化诱导液③100ng/ml IGF-1+50μmol/L AG490的矿化诱导液④50μmol/L AG490的矿化诱导液,分别刺激牙髓细胞7d、14d和21d,在室温下用4%的多聚甲醛固定30min,分别进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析。茜素红染色后每孔加入1ml10%氯化十六烷基吡啶,测定562nm波长下OD值。RT-PCR检测成牙/成骨基因m RNA的表达:在上述4组矿化诱导14d的牙髓细胞中加入1ml TRIzol,参考TRIzol说明书提取总RNA。根据M-MLV第一链合成系统操作说明书反转录获得单链c DNA,使用RT-PCR检测ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA表达。Western blot及免疫荧光法检测JAK-STAT通路JAK2蛋白磷酸化水平:用含蛋白磷酸酶抑制剂的细胞裂解液RIPA将上述4组矿化诱导4h后的牙髓细胞裂解,提取总蛋白,采用SDS-PAGE凝胶电泳,随后转至PVDF膜,牛奶蛋白封闭后,分别孵育p-JAK2(1:1000)与GAPDH(1:1000)一抗及抗兔Ig G二抗(1:20000),最后用双色红外激光扫描仪进行扫膜,Image J软件分析结果。将处于对数生长期的牙髓细胞消化,以104个/ml浓度的细胞悬液接种于六孔板中,培养24h后,更换为上述4组矿化诱导液,继续培养4h,用4%多聚甲醛固定细胞30min,随后用山羊血清封闭30min,再分别孵育兔抗p-JAK2一抗(1:100)与抗兔Ig G二抗(1:1000),最后加入DAPI将细胞核蓝染,立刻在免疫荧光显微镜下观察。用SPSS 13.0统计软件,数据结果以均数±标准差表示,采用单因素方差分析及S-N-K法进行统计学分析,P0.05为有统计学意义。结果:1在体外成功分离和培养出人牙髓细胞,免疫组化法鉴定细胞证实牙髓细胞为中胚层间充质细胞来源。2通过MTT法检测IGF-1不同浓度(5~100ng/ml)对牙髓细胞增殖的影响,结果为牙髓细胞培养至第5d和7d时,25、50、100ng/ml IGF-1组增殖均高于对照组(P0.05),并随浓度升高,细胞增殖越多,100ng/ml IGF-1组细胞增殖显著(P0.01)。本实验发现IGF-1+AG490组可以明显抑制牙髓细胞的增殖作用(P0.01)。3 IGF-1组7d、14d及21d形成的矿化结节含量及ALP染色均明显多于Control/M组,而IGF-1+AG490组矿化结节形成量较IGF-1组少,差异均有统计学意义(P0.05)。4 RT-PCR检测4组矿化诱导液培养14d的人牙髓细胞,发现IGF-1组中ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA表达升高,且差异显著(P0.05),IGF-1+AG490组中ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA水平明显低于IGF-1组(P0.05),与茜素红及ALP染色结果一致。5矿化诱导液诱导牙髓细胞4h后,通过Western blot及免疫荧光染色检测JAK-STAT通路中JAK2蛋白磷酸化水平,结果显示IGF-1组磷酸化JAK2(p-JAK2)蛋白表达高于对照组,而IGF-1+AG490组明显低于IGF-1组(P0.05)。结论:1采用组织块酶消化法,在体外成功培养出大量人牙髓细胞,并经免疫组化鉴定其来源于中胚间充质干细胞,第3~4代牙髓细胞增殖能力强、细胞形态良好,符合后续实验要求。2 25~100ng/ml IGF-1可以促进牙髓细胞的增殖,具有浓度依赖性,100ng/ml IGF-1是促进牙髓细胞增殖和矿化的最佳浓度。3 IGF-1作用于牙髓细胞使JAK2蛋白磷酸化水平升高,IGF-1可能通过JAK-STAT信号通路促进牙髓细胞的增殖和分化,同时可以提高成骨分化蛋白ALP、OCN、OPN和成牙本质分化蛋白DSPP基因的m RNA表达。
【关键词】：牙髓细胞 JAK-STAT 胰岛素样生长因子-1 矿化 AG490 牙本质涎磷蛋白 骨钙素
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-13
• 前言13
• 材料与方法13-23
• 结果23-26
• 附图26-34
• 附表34-35
• 讨论35-39
• 结论39-40
• 参考文献40-43
• 综述 胰岛素样生长因子-1 对人体多能干细胞生物活性的影响及机制 的研究进展43-52
• 参考文献47-52
• 致谢52-53
• 个人简历53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 刘俊,李玉晶;应用不同方法进行人牙髓细胞原代培养的比较研究[J];北京口腔医学;2005年03期

2 谢家敏;田卫东;刘磊;;胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖和分化的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年01期

3 徐皑;吴桂堂;刘兴容;;胰岛素样生长因子-Ⅰ和转化生长因子-β1对人牙髓干细胞增殖和分化影响的研究[J];现代预防医学;2014年12期

4 宋静;何健民;李珊;闫雪萍;卢欢;;牙周膜干细胞成骨分化中细胞因子的作用[J];中国组织工程研究;2013年10期

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本文编号：421809