阿司匹林对牙髓干细胞体外增殖、分化的影响及分子机制的研究

发布时间：2017-08-24 11:16

  本文关键词：阿司匹林对牙髓干细胞体外增殖、分化的影响及分子机制的研究

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【摘要】：人牙髓干细胞(human pulp stem cell,hDPSCs)是存在于牙髓组织中的未分化细胞,能够自我更新,在一定诱导条件下可分化形成牙本质样细胞,并保持组织的稳定性。与其他成体干细胞相比,人类牙源性干细胞表现出很强的增殖活力,并且在不同诱导条件下,均能表现出极强的分化能力;同BMMSCs相较,hDPSCs更易向成牙方向分化,经体外诱导高表达IIIβ-tubulin(TUBB3)、MAP-2证明该细胞有强烈的神经分化潜力,并且这种分化活力的大小同细胞所处的生长微环境关联紧密,不可分割。有研究表明受到炎性刺激的牙髓干细胞比正常的hDPSCs,ALP、OCN、RUNX-2等成骨基因明显增加,并有着更强的自我复制力。因此我们认为hDPSCs作为一种内源性间充质干细胞可能参与修复性牙本质形成,但其调控机制尚不清楚。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)以及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)皆是重要的细胞信号通路,在多种病理生理机制和效应中有着不可忽视的作用。MAPK是骨缺损模型的重要的调节器,影响骨细胞的吸收跟再生,促进骨基质沉积跟矿化。已有研究表明,多种药物可通过调节人间充质干细胞的MAPK的p-JNK、p-p38蛋白表达,影响其成骨向分化;而在hDPSCs中,药物促进细胞分化则是通过mapk的p38、erk通路来实现的。由此看出,不同干预条件以及细胞类型mapk调节分化的方式有差异。阿司匹林(aspirin)又称乙酰水杨酸(acctylsalicylicacid,asa)是一种非甾体类抗炎药,其疗效稳定、副反应少并且治疗范围广。百余年来,阿司匹林研究不断深入,新的药理作用也不断发现,阿司匹林有多种生物学途径,降低炎性因子水平。阿司匹林在调控细胞分化方面也发挥重要作用,乙酰水杨酸类物质可以抑骨髓基质细胞的增殖分化与迁移,而阿司匹林作为常用抗炎药物,有关其对hdpscs的作用尚不清楚,阿司匹林是否可以调节hdpscs的分化,目前尚未见相关报道。本实验研究阿司匹林刺激细胞增殖及分化所用及分化相关机制,据此推测hdpscs在体内的状态,为临床用药提供实验数据参考。主要研究结果如下:1、hdpscs的分离、培养和鉴定收集18-25岁健康成年人完好无龋的正畸牙或第三磨牙联合改良组织块酶消化法,成功分离培养出原代人类牙髓细胞(humandentalpulpcells,hdpcs),采用有限稀释法挑选出生长状态优良的单克隆细胞并扩大传代得到纯化的hdpscs,利用流式细胞仪对细胞表面抗原标记cd-105、cd-146等进行鉴定,并通过矿化诱导实验检测其成骨/成牙向分化能力,以此说明该细胞为间充质来源并且可以通过诱导向成骨/成牙方向分化。2、aspirin对hdpscs体外增殖能力的影响mtt结果显示不同浓度的阿司匹林对于hdpscs的影响有剂量依赖性的特点。根据阿司匹林在体内的药代动力学,分别选5mmol/l、0.5mmol/l、0.05mmol/l、0.005mmol/l的不同浓度的阿司匹林刺激在二维平面空间上生长的hdpscs一天、三天、五天、七天,当阿司匹林浓度为0.05mmol/l和0.005mmol/l培养三天后细胞扩增趋势明显(p0.05),浓度为0.5mmol/l时同对照组相比促进作用不明显。当浓度大于5mmol/l时,阿司匹林明显抑制细胞生长(p0.05),进而我们推测中高浓度的阿司匹林对hdpscs可能有毒性作用。而细胞增殖的edu实验结果也同mtt结果相一致。3、Aspirin对hDPSCs体外分化能力的影响取4代hDPSCs,待细胞长至80%—90%融合时,实验组为矿化液中加入阿司匹林配制成0.005、0.05、0.5mmol/L的刺激液,单独矿化液组及不加矿化液组作为对照组连续培养14d茜素红染色观察各组矿化结节以及PCR技术检测相应成骨基因含量表达情况。茜素红结果显示:肉眼直视下与对照组相比,0.5mmol/L和0.05mmol/L浓度的阿司匹林能减少矿化结节的产生,且实验组组间无明显差异,但阿司匹林浓度0.005mmol/L时与对照组无明显差异。倒置显微镜下观察,细胞状态良好,矿化结节数量均一,茜素红定量结果同肉眼直视下结果并无差异。PCR结果显示,同对照组相比,0.5mmol/L、0.05mmol/L的阿司匹林矿化组的ALP、OCN、DMP1基因均有不同程度的下调,其中0.5mmol/L药物刺激组最明显。由此我们推测Aspirin可能对hDPSCs矿化产生抑制的作用。4、Aspirin对hDPSCs体外分化能力作用机制的研究取4代hDPSCs加入0.5mmol/L阿司匹林,诱导时间分别为15min、30min、60min,以10%ɑ-MEM作为对照组。提取总蛋白,利用免疫印迹技术探究丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)以及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路在阿司匹林干预hDPSCs矿化中的作用。与对照组相比,0.5mmol/L阿司匹林可抑制矿化结节的形成;Western blot结果显示随着刺激时间延长p-p38、p-JNK的表达量均明显下降,NF-κB表达上调,而p-ERK表达则无明显变化。进行矿化诱导14天,阿司匹林加相应通路抑制剂组以及矿化组作为对照,相关通路抑制剂包括MAPK(ERK、JNK和P38)抑制剂(U0126、SP600125和SB203580),NF-κB的P65抑制剂PDTC,茜素红染色观察其矿化结节的多少,其肉眼观和镜下结果同western结果相一致。依照上述实验结果我们猜测,阿司匹林抑制牙髓干细胞成牙向分化可能是通过影响MAPK的p38、JNK、NF-κB信号通路实现的,而ERK可能不参与。进一步深入研究阿司匹林对hDPSCs作用的细胞其他信号途径,将有利于探讨临床应用此药物时对牙髓干细胞的影响,有利于进一步探索其在牙髓再生方面的应用。
【关键词】：阿司匹林 人牙髓干细胞 成牙分化 MAPK通路 NF-κB通路
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R78
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-23
• 第一部分 hDPSCs的分离培养与鉴定23-29
• 1 材料23-24
• 2 方法24-26
• 3 结果26-27
• 4 讨论27-29
• 第二部分 阿司匹林对牙髓干细胞增殖能力影响的研究29-35
• 1 材料30-31
• 2 方法31-32
• 3 结果32-33
• 4 讨论33-35
• 第三部分 阿司匹林对牙髓干细胞骨向/牙向分化能力的作用35-43
• 1 材料36-37
• 2 方法37-40
• 3 结果40-41
• 4 讨论41-43
• 第四部分 阿司匹林对牙髓干细胞分化机制的研究43-49
• 1 材料44-45
• 2 步骤45-47
• 3 结果47-48
• 4 讨论48-49
• 小结49-50
• 参考文献50-60
• 附录60-67
• 个人简历和研究成果67-68
• 致谢68

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本文编号：731007