IL-24联合自噬抑制剂影响口腔鳞癌生长作用的研究

发布时间：2017-09-13 07:28

  本文关键词：IL-24联合自噬抑制剂影响口腔鳞癌生长作用的研究

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【摘要】：口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度较高,具有容易向周围神经、腺体、肌肉及骨组织广泛浸润的特点,且易发生早期淋巴结转移。传统的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗及化学药物治疗等。手术治疗在切除肿瘤的同时,往往会造成大面积的颜面部组织缺损,给患者的身心带来极大的创伤。而放疗与化疗在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也会造成损伤,并且易引发免疫功能下降、骨髓抑制、肝肾损害、甚至死亡等严重并发症。因此,寻求一种新的、有效的治疗方法是目前治疗口腔鳞状细胞癌的研究热点。伴随着细胞和分子生物学技术的发展,基因疗法为肿瘤治疗提供了新的思路。白细胞介素24(Interleukin-24,IL-24)是一种新型的具有肿瘤特异性的细胞凋亡诱导因子,其不仅可抑制肿瘤细胞的生长,诱导其凋亡,还可提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性、抑制肿瘤内血管生成及诱导宿主发生抗肿瘤相关的免疫应答反应,而对正常细胞并没有明显的损伤作用。但是也发现,与肿瘤放化疗类似,肿瘤细胞对IL-24时常会产生治疗抗性,肿瘤细胞产生的治疗抗性是临床非手术治疗失败导致肿瘤复发的重要原因之一。近年研究显示,细胞自噬(Autophagy)可以将肿瘤细胞受损的细胞器及一些大分子物质运送至溶酶体中降解,从而为肿瘤细胞的存活提供一种自我保护机制,由此为肿瘤细胞逃避放疗及化疗引起的损伤而继续存活提供了保障。因此,细胞自噬作为肿瘤细胞的耐药机制之一被人们所广泛关注,并试图通过控制细胞自噬实现临床肿瘤治疗的有效性。虽然IL-24对多种恶性肿瘤均表现出较强的抑制作用,但是对口腔鳞状细胞癌而言IL-24是否同样可以抑制其生长以及在给药过程中可否诱发耐药均无相关文献报道。本文为探讨口腔鳞状细胞癌的IL-24生物治疗可行性,从IL-24的有效浓度、细胞内表达特征、抑制生长的作用机制做了系统的分析,并进一步深入研究了IL-24作用口腔鳞状细胞癌细胞及肿瘤组织后对细胞自噬的诱导情况,同时探讨了IL-24联合细胞自噬抑制剂3-MA用于抑制口腔鳞状细胞癌增殖和生长的有效性。在研究中,首先在确定新型杂合病毒载体Ad LTR2EF1α以及重组了IL-24基因的Ad LTR2EF1α-IL-24重组体感染细胞的有效浓度的基础上,分析IL-24重组体表达能力及重组蛋白的类型,证实该重组体可有效表达细胞内储留型及分泌型两种类型的IL-24蛋白。进而,将Ad LTR2EF1α-IL-24感染人口腔鳞状细胞癌细胞系KB细胞,以探讨IL-24对口腔鳞癌细胞的生长抑制作用。结果发现Ad LTR2EF1α-IL-24可以有效的抑制KB细胞增殖和小鼠KB细胞移植瘤的生长,而作为正常细胞对照的人永生化上皮细胞Ha Ca T细胞及移植瘤鼠的肝脏,心脏,肺脏等正常器官而言均无明显的损伤作用。此结果表明,IL-24可以有效的抑制口腔鳞癌细胞的增殖及生长而对正常细胞无明显毒副作用。为了探讨IL-24抑制口腔鳞癌细胞增殖和肿瘤生长的机制,研究检测了口腔鳞癌细胞系KB体外感染IL-24重组体和KB细胞荷瘤鼠瘤周注射IL-24后肿瘤细胞的增殖活性、细胞周期变化、凋亡状态、凋亡相关蛋白表达量及表达活性的变化。结果表明,IL-24可以增强口腔鳞癌细胞中凋亡相关蛋白的表达量及表达活性,从而增强口腔鳞癌细胞的凋亡,进而抑制口腔鳞状细胞癌的增殖及生长。在研究以上细胞生物学作用的同时,本研究深入分析了IL-24感染KB细胞后,KB细胞的结构特征,结果发现用IL-24感染的KB细胞内产生大量的具有双层膜的囊泡状结构。进一步采用透射电镜观察、GFP-LC3转染、MDC染色和western blot检测自噬相关蛋白等方法,证实这些具有双层膜结构的囊泡即为自噬体。由此表明,IL-24在诱导KB细胞凋亡抑制其增殖和瘤体生长的同时,也具有诱导KB细胞的细胞自噬作用。由此提示KB细胞可以通过保护性自噬作用对IL-24产生抵抗,从而影响IL-24对KB细胞及其肿瘤组织的有效杀伤作用。为了解决IL-24重组蛋白在抑制口腔鳞状细胞癌增殖生长的同时伴发的保护性细胞自噬问题,本文在研究中探讨了IL-24联合细胞自噬抑制剂3-MA用于抑制口腔鳞状细胞癌增殖和生长的有效性,以期通过抑制自噬进一步提高IL-24抑制肿瘤的作用。实验应用经典的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)联合IL-24处理口腔鳞状细胞癌KB细胞,分析了联合应用自噬抑制剂后KB细胞的增殖活性、细胞周期阻滞效果和移植瘤生长能力。结果表明,自噬抑制剂可以有效的增加IL-24诱导的细胞凋亡,增强IL-24对口腔鳞状癌细胞的生长抑制作用。综上所述,本研究通过不同方法从不同角度阐述了IL-24对口腔鳞状细胞癌的生长抑制作用,并证明促进口腔鳞状细胞癌的凋亡是IL-24抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤生长的主要机制。同时,本研究还发现IL-24可以诱发口腔鳞状细胞癌的自噬活性,深入探讨了抑制口腔鳞状细胞癌的保护性自噬可以提高IL-24对口腔鳞状细胞癌的生长抑制作用。这些结果将为IL-24及自噬抑制剂联合应用于治疗口腔鳞状细胞癌的临床研究提供可靠的理论依据。
【关键词】：口腔鳞状细胞癌 IL-24 细胞凋亡 细胞自噬 基因治疗
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.85
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 第1章 绪论15-36
• 1.1 课题背景及研究的目的和意义15-16
• 1.2 口腔鳞状细胞癌16-26
• 1.2.1 口腔鳞状细胞癌的易感因素16-18
• 1.2.2 口腔鳞状细胞癌的分子生物学研究进展18-24
• 1.2.3 口腔鳞状细胞癌的临床治疗24-26
• 1.3 IL-24与肿瘤的基因治疗26-30
• 1.3.1 IL-24的结构27
• 1.3.2 IL-24在人体中的表达27-28
• 1.3.3 IL-24的受体28
• 1.3.4 IL-24的抗肿瘤作用28-30
• 1.4 细胞自噬30-33
• 1.4.1 自噬与肿瘤30
• 1.4.2 自噬与肿瘤细胞的耐药30-32
• 1.4.3 自噬与肿瘤细胞凋亡32-33
• 1.5 本文的主要研究内容和技术路线33-36
• 1.5.1 本文的主要研究内容33-34
• 1.5.2 本研究的技术路线34-36
• 第2章 实验材料与方法36-50
• 2.1 实验材料36-39
• 2.1.1 细胞系及原代细胞36
• 2.1.2 病毒载体36
• 2.1.3 主要仪器36-37
• 2.1.4 主要实验试剂37-38
• 2.1.5 实验用小鼠38
• 2.1.6 主要试剂配置38-39
• 2.2 实验方法39-48
• 2.2.1 细胞培养39-40
• 2.2.2 病毒感染40-41
• 2.2.3 最佳转染浓度测定41
• 2.2.4 Ad LTR2EF1α-EGFP载体转基因表达测定41-42
• 2.2.5 Ad LTR2EF1α-IL-24载体转基因表达测定42
• 2.2.6 IL-24外分泌表达检测42-43
• 2.2.7 MTT检测细胞活性43
• 2.2.8 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡43
• 2.2.9 TUNEL法检测细胞凋亡43-44
• 2.2.10 细胞周期检测44-45
• 2.2.11 MDC染色检测自噬体45
• 2.2.12 透射电镜45
• 2.2.13 GFP-LC3 染色检测自噬体45-46
• 2.2.14 免疫印迹（Western blotting）46-48
• 2.2.15 动物实验48
• 2.2.16 免疫组化48
• 2.2.17 统计学分析48
• 2.3 本章小结48-50
• 第3章 IL-24重组体在OSCC细胞中的表达及其作用50-70
• 3.1 引言50
• 3.2 IL-24重组体最佳感染浓度测定50-53
• 3.3 IL-24在OSCC细胞中的表达53-59
• 3.3.1 IL-24重组体在OSCC细胞中的基因转录情况53-55
• 3.3.2 IL-24重组体感染后OSCC细胞中IL-24蛋白的表达情况55-59
• 3.4 IL-24重组体抑制口腔鳞状细胞癌的生长59-69
• 3.4.1 IL-24重组体抑制口腔鳞癌细胞的增殖59-61
• 3.4.2 IL-24重组体对口腔鳞癌细胞周期的影响61-63
• 3.4.3 IL-24重组体抑制口腔鳞状细胞癌移植瘤的生长63-66
• 3.4.4 IL-24重组体对荷瘤裸鼠正常脏器形态的影响66-69
• 3.5 本章小结69-70
• 第4章 IL-24影响OSCC细胞凋亡与自噬作用的研究70-86
• 4.1 引言70
• 4.2 IL-24促进OSCC细胞的凋亡70-73
• 4.3 IL-24增强OSCC细胞中凋亡相关蛋白的表达及活性73-75
• 4.4 IL-24提高OSCC细胞的自噬水平75-84
• 4.4.1 IL-24重组体感染OSCC细胞诱发细胞自噬76-81
• 4.4.2 IL-24引起自噬相关蛋白表达的增加81-84
• 4.5 本章小结84-86
• 第5章 抑制自噬增强IL-24对OSCC细胞的增殖抑制作用86-103
• 5.1 引言86
• 5.2 自噬抑制剂 3-MA增强IL-24对OSCC细胞的生长抑制作用86-94
• 5.2.1 IL-24联合 3-MA对KB细胞增殖活性的影响86-88
• 5.2.2 IL-24联合 3-MA对KB细胞周期的影响88-90
• 5.2.3 IL-24联合 3-MA对KB细胞移植瘤生长的影响90-94
• 5.3 3-MA增强IL-24对OSCC细胞增殖抑制作用机制的研究94-99
• 5.3.1 IL-24联合 3-MA提高KB细胞的凋亡水平94-97
• 5.3.2 IL-24联合 3-MA提高KB细胞中凋亡相关蛋白的表达量及活性97-99
• 5.4 自噬与凋亡在肿瘤发生发展中的内在联系99-102
• 5.5 本章小结102-103
• 结论103-105
• 参考文献105-118
• 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果118-120
• 致谢120-121
• 个人简历121

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本文编号：842356