Smad3与C-jun调控成釉细胞Mmp20基因转录活性的研究

发布时间：2017-09-13 12:27

  本文关键词：Smad3与C-jun调控成釉细胞Mmp20基因转录活性的研究

  更多相关文章： C-jun 基质金属蛋白酶-20 Mmp20 Smad3 成釉细胞

【摘要】：目的通过分析Mmp20基因下游启动子上的AP-1位点和Smad位点,探讨C-jun和Smad3在Mmp20基因表达中的作用。方法1、对p-Mmp20的分析：首先构建包含不同长度p-Mmp20片段的荧光素酶报告基因载体；然后通过双荧光素酶检测Smad3对其转录活性的影响；并将小鼠有功能的Mmp20启动子基因序列与人的相应序列进行BLASTN分析及TFSEARCH、TESS分析。2、Smad3促进p-Mmp20转录活性的研究：首先双荧光素酶分析不同剂量Smad3对p-Mmp20 (-157bp～+23bp)活性的影响；其次凝胶迁移实验观察Smad3核蛋白与标记探针的相互作用；利用基因定点突变技术使Mmp20启动子序列(-157bp～+23bp)内Smad及AP-1位点突变,然后双荧光素酶观察Smad3对野生型及突变型启动子活性的影响。3、C-jun影响Mmp20基因表达的研究：首先双荧光素酶分析不同剂量C-jun对p-Mmp20 (-157bp～+23bp)活性的影响及C-jun对p-Mmp20 (M3-MT-SBS, M3-MT-ABS, M3-MT-DS)活性的影响；其次通过凝胶迁移实验观察C-jun核蛋白与标记探针之间的结合；然后双荧光素酶观察C-jun与Smad3对p-Mmp20 (-157bp～+23bp)活性的调节。4、磷酸化C-jun与磷酸化Smad3在ALC中表达的研究：利用RT-PCR技术检测在Smad3存在情况下,C-jun对Mmp20基因表达的影响；利用免疫组化技术研究磷酸化C-jun与磷酸化Smad3在ALCs内的表达。5、分析Smad3通路与JNK通路在Smad3、C-jun调控Mmp20基因表达中的作用：利用RT-PCR分析在Smad3 inhibitor存在情况下,C-jun对Mmp20基因表达的影响；利用RT-PCR分析在JNK inhibitor存在情况下,Smad3对Mmp20基因表达的影响。 结果1、双荧光素酶检测不同长度Mmp20启动子的荧光素酶活性发现：从-157bp～-73bp之间存在顺式作用元素。BLASTN分析发现人鼠该序列具有同源性。TFSEARCH、TESS分析该功能性序列得到Smad及AP-1结合位点。2、双荧光素酶分析发现Smad3促进p-Mmp20 (M3)的荧光素酶活性并具有剂量依赖性；电泳迁移率实验可以观察到含Smad结合位点的探针与Smad3核蛋白具有相互作用；双荧光素酶检测发现,Smad3过表达可上调M3的转录活性；与M3-WT相比,Smad3位点的突变可明显抑制M3的活性(P0.05)。3、双荧光素酶检测发现：低剂量的C-jun促进M3启动子活性,高剂量的C-jun抑制M3启动子活性；AP-1位点突变后,只是轻微改变C-jun对M3启动子活性的抑制效应,Smad位点突变后,C-jun明显增强M3启动子活性,AP-1及Smad位点均突变后完全消除C-jun对M3活性的影响。凝胶迁移实验得出C-jun核蛋白可以与标记探针上的AP-1位点结合,C-jun与Smad3的复合物可以与标记探针上的Smad位点结合。双荧光素酶检测发现在C-jun存在的情况下,Smad3抑制M3的活性。4、RT-PCR分析：低剂量C-jun促进Mmp20 mRNA的表达与Smad3没有明显联系；与对照组相比,在Smad3存在的情况下,高剂量C-jun明显抑制Mmp20的表达。免疫组化分析发现p-Smad3在出生后3d、5d、7d小鼠下颌第一磨牙成釉细胞核内的分布含量没有明显改变；而p-C-jun的含量逐渐增加。5、RT-PCR分析发现在Smad3 inhibitor存在的情况下,C-jun促进Mmp20表达；在JNK inhibitor作用下,Smad3增强Mmp20表达。 结论证实Smad3通过作用于p-Mmp20上的Smad位点促进Mmp20表达；低剂量C-jun通过p-Mmp20上的AP-1位点促进Mmp20的表达,高剂量C-jun与Smad3形成复合物通过Smad位点抑制Mmp20的表达；JNK通路参与了Smad3对Mmp20表达的调节,Smad3通路参与了C-jun对Mmp20表达的调节。
【关键词】：C-jun 基质金属蛋白酶-20 Mmp20 Smad3 成釉细胞
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 缩略词表9-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-34
• 结果34-44
• 讨论44-47
• 结论47-48
• 参考文献48-51
• 文献综述51-57
• 参考文献55-57
• 致谢57-58
• 攻读学位期间发表的论文58

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本文编号：843736