体外连续培养人牙髓干细胞干性特征改变的相关研究

发布时间：2017-09-23 05:45

  本文关键词：体外连续培养人牙髓干细胞干性特征改变的相关研究

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【摘要】：牙髓干细胞(Dental pulp stem cell,DPSCs)是成体干细胞(Adult-derived stem celsl,ASCs)家族的重要成员之一,起源于神经嵴来源的间充质细胞[1],是从牙髓组织中提取分离出来的少量具有干细胞特性的未分化细胞。特定诱导条件下可定向分化为骨、软骨、脂肪、神经、肝、心肌等多种组织细胞[2]。因其具有较骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)更高的分化程度,以及取材简单,创伤小,来源广泛,较强的分化潜能和自我更新能力[3],目前被认为是组织工程学理想的种子细胞。但原代培养获得人牙髓干细胞数量有限,须经体外扩增才能获得足够的种子细胞,而已有研究发现间充质干细胞在体外培养环境下会出现不同程度的衰老,有关牙髓干细胞体外连续传代后生物学活性的改变尚不明确。研究目的:本研究旨在通过观察牙髓干细胞在体外连续传代后细胞增殖、分化和自我更新能力等的变化,以探究体外培养环境对牙髓干细胞干性的影响,为研究干细胞干性维持机制以及指导牙髓干细胞组织工程学临床应用提供一定理论依据。实验方法和结果如下:1.人牙髓干细胞(Human Dental Pulp Stem Cells,HDPSCs)分离、培养、纯化和鉴定采用I型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离获得人原代牙髓细胞(Human Dental Pulp Cells,HDPCs),有限稀释法挑选单克隆纯化牙髓细胞;流式细胞仪检测表明细胞高表达CD29、CD90、CD105、CD146和Stro-1表面标记分子,但CD34、CD45表达阴性,说明所获细胞来源于间充质;茜素红染色、ALP染色和油红O染色阳性结果证实细胞具有向成牙本质/成骨细胞以及成脂细胞分化能力,实验结果表明已成功培养获得h DPSC。2.连续传代对h DPSCs形态、细胞表型以及衰老的影响体外二维条件培养h DPSCs并连续传代,分别以P4、P8、P12、P16、P20 h DPSCs为研究对象,结果显示:(1)P4 h DPSCs形小、呈圆形,随着代数的增加,细胞形态逐渐变为不规则,体积变大。(2)流式细胞仪检测发现各代h DPSCs表面标记物CD29、CD90表达无明显差异(P0.05),而与间充质干细胞密切相关的CD105、CD146表达随代数增加逐渐降低(P0.05)。(3)SA-β-半乳糖苷酶染色显示P4 h DPSCs无明显的衰老现象,但P16、P20衰老细胞比例显著上调(P0.01)。3.体外连续培养h DPSCs增殖、分化以及克隆形成能力的影响(1)MTT检测结果显示P4 h DPSCs增殖最快,随后增殖能力逐代降低(P0.05)。细胞周期结果显示各代S期细胞所占总细胞数比例随代数增加呈现降低趋势。(2)分化能力检测发现体外诱导各代h DPSCs成牙本质/成骨细胞向分化14天,茜素红着色随代数的增加逐渐变浅,镜下观矿化结节数减少,Real-time PCR检测显示成牙本质细胞分化标记蛋白DSPP,RUNX2 m RNA表达水平随代数的增加而降低(P0.05)。体外诱导h DPSCs成脂向分化30天,油红O染色结果显示脂滴形成数随代数的增加而减少,Real-Time PCR检测PPAR-γ随代数的增加而降低(P0.05)。(3)甲苯胺蓝染成纤维细胞集落形成率(Colony forming unit fibroblastic,CFU-F)实验显示随代数的增加,克隆结节形成数目逐渐减少,表明h DPSCs随体外传代次数的增加克隆形成能力降低,自我更新能力减弱。(4)RT-PCR检测各代h DPSCs内生长因子IGF-2、TGF-β、HGF、FGF-2、VEGF、EGF、FGF-4、IL-6表达情况,结果显示FGF、TGF-β随代数增加表达减少,IGF-2、HGF、VEGF表达在P8 h DPSCs时显著增强,HGF在P20 h DPSCs中出现一过性的高表达,h DPSCs不表达EGF、FGF-4、IL-6。4.连续传代对干性相关因子表达的影响(1)Real-time PCR检测各代h DPSCs Oct4可变剪接体(Oct4A,Oct4B)以及干性分子(Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog)表达改变,结果发现剪接体Oct4A和干性分子(Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog)在h DPSCs中表达,Oct4A表达量随代数增加无明显变化(P0.05),而c-Myc表达显著上调后又逐渐下调,干性基因Sox2,Klf4和Nanog表达随代数增加呈降低趋势(P0.05),但各代h DPSCs剪接体Oct4B表达均为阴性。(2)激光共聚焦显微镜观察连续传代Oct4A定位改变,发现P4、P8 h DPSC中,Oct4A主要表达于细胞核,P12 h DPSCs中Oct4A表达逐渐从胞核向胞浆转位。P16、P20 h DPSCs中Oct4A表达主要定位于胞浆,提示Oct4A转位可能与干细胞干性的减弱有关。综上所述,本研究初步证明h DPSCs在体外扩增培养过程中其增殖、成牙本质/成骨向分化能力、自我更新能力等干性特征逐渐减弱,进一步研究发现,干性相关分子中Sox2、Klf4和Nanog表达随代数增加呈降低趋势,而Oct4可变剪接体Oct4A表达量随代数增加虽无明显改变但出现胞核向胞浆转位,提示可能干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A可能在h DPSCs干性维持中发挥着至关重要的作用,本课题今后进一步的研究将集中探讨干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A转位改变的功能作用,以期寻找到维持h DPSCs干性的的关键机制,为h DPSCs在再生医学中的推广应用奠定理论基础。
【关键词】：牙髓干细胞 传代 干性 衰老
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.3
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文献回顾14-22
• 第一部分 人牙髓干细胞的分离、培养、纯化和鉴定22-30
• 1 材料22-23
• 2 方法23-25
• 3 结果25-28
• 4 讨论28-30
• 第二部分 连续传代对h DPSCs细胞生物学活性的影响30-44
• 1 材料30-31
• 2 方法31-35
• 3 结果35-41
• 4 讨论41-44
• 第三部分 连续传代对干性相关因子表达的影响44-52
• 1 材料44-45
• 2 实验方法45-48
• 3 结果48-50
• 4 讨论50-52
• 小结52-53
• 参考文献53-62
• 个人简历和研究成果62-63
• 致谢63

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本文编号：903554