p75NTR在大鼠颌突外胚间充质干细胞体外矿化过程中表达变化的研究
发布时间：2017-10-08 16:35
本文关键词：p75NTR在大鼠颌突外胚间充质干细胞体外矿化过程中表达变化的研究
【摘要】：研究背景牙齿缺失几乎是每个人一生当中必须面对的问题,特别是社会逐步进入人口老龄化的今天,这一问题尤为普遍,对人类健康的危害和生活质量的影响也越来越突出。目前临床上解决这一问题的主要手段是义齿,但无论是在功能还是感觉上,都无法与天然牙相比。因此需要一种与天然牙具有最为相似或者完全相同功能的修复体,无疑组织工程化牙齿是较为理想的选择,但由于牙齿发育的确切机制尚未明确,制约了组织工程化牙齿的发展进程。而模拟牙发育外胚间充质-上皮作用理论的细胞重聚技术为组织工程化牙齿发展注入新的理念,作为牙源性干细胞的始祖细胞——颅神经嵴来源的EMSCs是细胞重聚技术获得再生牙最为理想的种子细胞。但当前对颅神经嵴来源的EMSCs的体外分化命运及影响因素了解还远远不够。因此,通过探讨不同胚龄EMSCs的矿化能力,了解其体外分化命运,有助于推进组织工程牙齿的发展进程,同时为组织工程化牙齿探寻良好的种子细胞。p75神经营养受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)作为神经营养因子的低亲和力受体,主要表达在神经细胞的早期发育中,被认为是颅神经嵴的经典标志物,参与细胞的生存、增殖、迁移、分化和凋亡等多重生物学效应。目前,p75NTR在神经系统发育和再生中的调控作用已得到较充分阐述,但是参与神经系统以外组织(如脂肪、肝脏、肌肉、牙齿等)形态发生的研究尚处于起步阶段,特别是在牙齿发育过程中的作用鲜有报道。本课题组前期的研究已证实,颅神经嵴细胞于大鼠E11.5d迁移至颌突组织,E12.5d牙发育尚未启动。本实验在以往研究的基础上进一步通过比较p75NTR在不同胚龄大鼠颌突EMSCs体外矿化过程中的表达变化,初步探讨p75NTR在颌突EMSCs矿化过程中的作用,为揭示牙齿发育的分子生物学机制提供实验基础。研究内容1.HE染色观察不同胚龄大鼠牙胚的形态观察受孕12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg),等待5-10min左右,行腹腔手术取出胚胎,4%多聚甲醛固定24h,包埋,按矢状面方向切片,厚度为8μm,HE染色,显微镜下观察、拍照。2.E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d SD大鼠颌突EMSCs的体外培养及鉴定受孕E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg),等待5-10min左右,行腹腔手术,无菌条件下取出胎鼠,切取颌突,切成0.1mm*0.1mm*0.1mm的组织块,胰酶消化、离心,经不锈钢筛网过滤后分别加入含100ml/L胎牛血清的培养基,置于5%CO2 37℃孵育箱中培养。分别从细胞形态、细胞增殖能力、细胞免疫荧光、流式细胞技术检测细胞表面抗原对E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5d EMSCs进行生物学鉴定。3.E12.5d、E13.5d、E15.5d和18.5d EMSCs体外矿化诱导分别对E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d颌突EMSCs进行矿化诱导,于诱导0d、7d、14d、21d后分别观察细胞形态、ALP活性、矿化能力、矿化相关基因蛋白以及p75NTR的表达变化。结果1.E12.5d大鼠牙胚处于牙板形成期,口腔上皮向组织内部生长形成的一种上皮性结构;E13.5 d进入牙胚发育的蕾状期,此时牙胚的牙板末端膨大,上皮细胞增生形成卵圆形或圆形的上皮芽,形似花蕾。E15.5 d大鼠牙胚的上皮芽继续生长、增大,长入上皮基底部向内凹陷形似帽子,覆盖在外胚间叶细胞聚集区,称为帽状期,成釉器分为三层细胞:即外釉上皮层、星网状层和内釉上皮层。其中成釉器下方的细胞聚集区称为牙乳头,形成牙本质和牙髓,包绕成釉器和牙乳头的外胚间叶细胞称为牙囊,形成牙支持组织。E18.5 d大鼠牙胚发育进入钟状期,上皮凹陷加深,周缘继续生长,形似吊钟,此时成釉器进入成熟期,分为4层细胞即外釉上皮层、星网状层、中间层和内釉上皮层,内釉上皮与外釉上皮相连处称为颈环。2.(1)体外分离、培养的E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5d EMSCs均为长梭型的成纤维样细胞,胞体丰满,细胞增殖能力强。(2)流式细胞检测:E12.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:92.93%、98.39%、95.49%、92.86%、91.44%、22.53%,E13.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:97.01%、96.64%、97.70%、98.26%、97.15%、82.42%,E15.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:95.65%、98.50%、98.49%、97.90%、99.51%、85.09%,E18.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表达率分别为:95.79%、96.97%、91.28%、97.92%、96.83%、81.43%,CD45在E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d EMSCs表达率分别为:5.78%、5.24%、8.34%、8.51%。E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d颌突EMSCs均阳性表达CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR,阴性表达CD45。3.(1)碱性磷酸酶染色结果:矿化诱导7d后,各实验组染色较对照组深,E18.5d EMSCs实验组染色最深。(2)茜素红染色结果:矿化诱导21天后,各组均有矿化结节形成,其结果与ALP染色结果一致,即E18.5d EMSCs实验组矿化结节形成量最多。(3)RT-PCR结果:矿化诱导7天后,各组提取总RNA,逆转录后进行PCR反应,各实验组ALP表达水平明显高于对照组,其中E18.5d EMSCs表达较高(P㩳0.05);矿化诱导14d后,各实验组矿化相关基因Runx2、Col I以及p75NTR m RNA表达高于对照组,在E18.5d EMSCs实验组表达较高(P㩳0.05);对照组p75NTR的表达未见明显变化。(4)Western blot结果:矿化诱导14d,矿化相关蛋白Runx2、Col I表达量在E18.5d EMSCs实验组较高,蛋白灰度值检测其差异有统计学意义(P㩳0.05);矿化前期各组p75NTR蛋白未见明显变化,而21d后各实验组明显高于对照组,蛋白灰度值检测其差异有统计学意义(P㩳0.05),各对照组间未见明显变化。结论通过不同胚龄颌突外胚间充质干细胞的培养、生物学鉴定和体外矿化诱导,以及对矿化相关基因蛋白的检测,发现E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d EMSCs均为颅神经嵴源性的间充质干细胞,其中E18.5d EMSCs增殖能力和矿化能力强,这说明E18.5d EMSCs是未来研究牙组织工程较为理想的种子细胞;流式检测发现p75NTR在E13.5d表达显著升高,并保持高表达,以及p75NTR在矿化诱导后表达明显升高,推测p75NTR可能参与成牙初期牙齿的发育。
【关键词】：颌突 外胚间充质干细胞 神经营养受体 矿化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781
【目录】：
- 缩略语表4-5
- 英文摘要5-9
- 中文摘要9-12
- 第一章 前言12-14
- 第二章 不同胚龄大鼠牙胚形态观察14-18
- 2.1 材料与方法14-16
- 2.2 结果16-17
- 2.3 讨论17-18
- 第三章 不同胚龄颌突外胚间充质干细胞的培养及生物学鉴定18-26
- 3.1 材料与方法18-21
- 3.2 结果21-25
- 3.3 讨论25-26
- 第四章 不同胚龄颌突外胚间充质干细胞体外矿化能力的研究26-37
- 4.1 材料与方法26-34
- 4.2 结果34-36
- 4.3 讨论36-37
- 全文小结37-38
- 参考文献38-41
- 文献综述 p75神经营养受体的研究进展41-51
- 参考文献47-51
- 硕士在读期间发表文章51-52
- 致谢52
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，本文编号：995136
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