上海地区诺如病毒分子流行病学调查及GII.4流行株进化规律的初步研究

发布时间：2020-06-24 22:32

【摘要】：目的1.明确2012.1-2013.12上海地区诺如病毒在成人中的分子流行病学特点。2.构建GII.4流行株体外分子进化模型,系统把握GII.4流行株进化趋势,同时筛选关键信息位点。3.明确国内近期GII.4流行株Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009及Sydney_2012的受体识别模式,同时评估三种流行株的抗原性,从受体结合功能及抗原性漂变两个方面初步探讨近期GII.4流行株的进化规律。方法1.上海地区成人诺如病毒的分子流行病学调查收集上海市两处哨点医院(长宁区中心医院和同济大学附属上海东方医院)成人(≥16岁)急性腹泻患者的粪便样本,同时系统搜集患者的临床信息。采用多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行诺如病毒的常规检测,阳性样本PCR产物直接外送测序并进行基因分型。2.GII.4流行株体外分子进化模拟研究以Camberwell_1994为原型株,收集1995年以来的GII.4流行株(US95_96、 Farmington_Hills_2002、Hunter_2004、Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009 及 Sydney_2012)主要衣壳蛋白VPl基因序列全长,通过多序列联配进行位点变异分析,并采用系统发育分析确定流行株的进化趋势,同时利用正向选择分析筛选关键信息位点,构建GII.4流行株体外分子进化模型。3.GII.4流行株进化规律的初步研究以近期Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009及Sydney_2012三种流行株为主要研究对象,分别构建pET-42a(+)AP1重组表达载体,采用Rosetta(DE3)原核表达体系进行体外蛋白表达和纯化。首先评估三种流行株VP1蛋白与ABO血型组织抗原的亲和力,其次采用流行株感染患者恢复期血清和健康成人血清,通过交叉反应及受体亲和抑制试验,从受体识别模式及抗原性漂变两个方向探讨GII.4流行株的进化规律。结果1.上海地区成人诺如病毒的分子流行病学调查2012年1月至2013年12月,共采集846份成人(≥16岁)急性腹泻患者粪便样本,其中2012年度387份,2013年度459份,全部样本均完成常规分子检测。GI群检出22例,检出率为2.60%；GII群检出117例,检出率13.83%。GI群呈现低位流行、全年散发的状态,无明显的季节分布；GII群在2012年10月-12月出现高位流行,检出率均在30%以上,11月份的检出率高达60%。同时发现,GII群诺如病毒相关的急性腹泻好发于中老年人,特别是46-55岁个体,检出率达20.30%,相比于35岁以下个体,46岁以上人群GII群检出率明显升高,差异有统计学意义(p0.05)。GI群在成人中的流行无明显年龄分布特征。对诺如病毒阳性样本进行基因分型发现,近两年来上海地区GI群主要的流行株为GI.3和GI.4。GII群中绝大部分为GII.4型,占93.40%,除既往Den Haag_2006b及New Orleans_2009流行株外,首次检测到新型变异株Sydney_2012。同时发现,2012年10-12月在上海地区高位流行的GII群均是该新型GII.4变异株,表明其已成为上海地区的优势株。回顾分析发现,Sydney_2012新型变异株在2012年9月份已经在上海地区出现。进一步分析证实Sydney_2012变异株为GII.e型ORF1与GII.4型ORF2的重组体,重组位点处于基因组5037bp-5062bpo2.GII.4流行株体外分子进化模拟的研究通过对188条VPI全长序列的比对分析,共检出57处变异频繁的氨基酸位点,其中40个突变位点集中在P2区,不同时期的流行株也出现重复使用相同氨基酸残基的现象。对VP1全长序列的系统进化分析显示,不同时期的流行株存在一定的进化距离,在进化树中以单一的簇存在。对VP1不同区域分别进行系统进化分析发现,仅P2区的进化趋势与VP1全长基因高度一致,而S区和P1区的进化分析显示各个时期流行株交错分布,无法表征不同时期流行株间的分子进化距离。正向选择分析共检出13处关键信息位点,其中9处集中于P2区。3.GII.4流行株进化规律的初步研究通过体外蛋白表达对近期Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009及Sydney_2012三种流行株的受体识别模式鉴定发现,三种流行株对不同型别的ABO组织血型抗原均显示出较高的亲和活性,表明近期流行株表现出受体亲和的广嗜性。采用健康成人及流行株感染恢复期血清行抗原抗体交叉反应发现,健康人群中超过80%为抗诺如病毒IgG抗体阳性,人群中普遍存在一定滴度的抗GII.4流行株IgG抗体。虽然Den_Haag_2006b和Sydney_2012流行株感染者恢复期抗血清与不同时期流行株均有较强的交叉反应,但二者均可特异性屏蔽同时期流行株衣壳蛋白与HBGA受体的亲和活性,对其他时期流行株则无显著的屏蔽作用。而健康成人血清对近期GII.4流行株的受体亲和活性也无明显抑制作用。结果提示GII.4流行株进化过程中出现抗原性漂变以逃避群体的保护性免疫,但简单的交叉反应无法分辨,须进行受体亲和抑制试验以鉴定功能性中和抗体。结论1.诺如病毒GII.4流行株呈现出周期性流行的特点,现阶段Sydeny_2012已取代Den_Haag_2006b和New Orleans 2009成为上海地区的优势流行株。2.P2区是GII.4流行株VP1蛋白分子进化的关键区域,进化趋势与VP1全长基因高度一致,受基因组空间的限制,GII.4流行株VPl序列中的位点变异主要集中在P2区,单位点的变异可能同时影响流行株的受体亲和及VP1蛋白的抗原性。3.近期GII.4流行株呈现出受体亲和的广嗜性,三种流行株均可感染较大规模的宿主人群且结合ABO组织血型抗原受体的种类并未发生显著性改变,但抗原性漂变持续存在,提示抗原性漂变可能是近期流行株在人群中大规模播散流行的最主要原因。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.5;R181.3
【图文】：

检出率,季节分布,急性腹泻,病毒

群检出１１７例，检出率１３．８３％。ＧＩ群呈现低位流行、全年散发的状态，无明显逡逑的季节分布；ＧＩＩ群在２０１２年１０月－１２月出现高位流行，检出率均在３０％邋Ｗ上，逡逑１１月份的检出率一度商达６０％邋（图１．１）。逡逑１３逡逑

质粒,反应体系,结构示意图,载体

图３．１邋ｐＥＴ－４２ａ（＋）质粒结构示意图逡逑采用ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｈｉｎｄ邋ＩＩＩ双酶切质粒ｐＧＭ－Ｔ／ＶＰｌ和ｐＥＴ－４２ａ（＋），反应体系如逡逑下：逡逑ＢａｍＨ邋１（１５Ｕ／阳逦叫逡逑Ｈｉｎｄ邋ＩＩＩ邋（１５１１／阳逦１邋叫逡逑载体（８０ｎｇ／叫）逦１２＾１１逡逑ｌ0ｘＫ邋Ｂｕｆｆｅｒ逦２邋山逡逑加去离子水至逦２０叫逡逑酶切反应在３７°Ｃ进行，温育２ｈ。反应结束后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶逡逑电泳，并从凝胶中回收酶切后的ＤＮＡ，操作步歘如前所述。逡逑２．２．３连接反应逡逑采用紫外分光光度计分别确定切胶回收后的ＶＰ１目的片段及ｐＥＴ－４２ａ（＋）载体逡逑浓度，按下列反应体系进行：逡逑

【共引文献】